Úvod E-learningové kurzy Fragmenty pro kontrolu kvality MLPA

Fragmenty pro kontrolu kvality MLPA

Provedeme vás učebním internetovým modulem, ve kterém si můžete vyzkoušet pracovat s fragmenty pro kontrolu kvality MLPA.

Po dokončení učebního modulu budete schopni

  • Vysvětlit funkci každého typu fragmentů pro kontrolu kvality MLPA.
  • Interpretovat signály kontrolních fragmentů v profilu píků.
  • Lokalizovat, pochopit a interpretovat výsledky každého kontrolního fragmentu, jak jsou generovány programem Coffalyser.Net.
  • Vyřešit problémy, které jsou detekovány fragmenty pro kontrolu kvality MLPA.

Chcete znát fragmenty pro kontrolu kvality MLPA? Vyzkoušejte si e-učební modul.

1. Přehled

Popis kontrolních fragmentů

Kontrolní fragmenty můžete nalézt v Tabulce 1 v popisu produktu, který je dodáván s každým kitem.

Příslušné kontrolní fragmenty v profilu píku

Klikněte na každý box a uvidíte příslušné kontrolní fragmenty v profilu píku a v dolní části si můžete přečíst odpovídající popis daného boxu.

Všechny MLPA kity obsahují fragmenty pro kontrolu kvality. Tyto krátké fragmenty umožňují provádět kontrolu kvality ve vašich experimentech MLPA.

Při procházení tohoto modulu, použijte ikonu v horním pravém rohu, kde naleznete barevnou legendu pro kontrolní fragmenty.

2. Q pro kvantitu – Kvantitativní fragmenty

Q - fragmenty

Pro získání spolehlivých výsledků je důležité mít k dispozici dostatek DNA ve vzorku
Je důležité mít k dispozici dostatek DNA ve vzorku pro získání spolehlivých výsledků.

Malé množství DNA může způsobit problémy s hybridizací sondy, což způsobuje proměnlivé poměry sond. Z tohoto důvodu je důležité kontrolovat množství DNA v každé reakci MLPA.

Každý kit MLPA obsahuje čtyři Q-fragmenty, které nabízejí nejlepší způsob, jak zjistit, zda váš vzorek obsahoval dostačující množství DNA.

Přesuňte kurzor na různé části každého Q-fragmentu a objeví se jejich popis

Přesuňte kurzor na různé části každého Q-fragmentu a objeví se jejich popis.

Každý kit MLPA obsahuje čtyři fragmenty pro kontrolu množství DNA.

Tyto Q-fragmenty, s délkami 64-70-76-82 nt, jsou jednotlivé oligonukleotidy skládající se z nehybridizující sekvence a dvou vazebných míst pro primery.

Vzhledem k tomu, že Q-fragmenty jsou jednotlivé oligonukleotidy, které obsahují obě vazebné sekvence pro primery, nemusí být ligovány, a ani nepotřebují přítomnost DNA, která má být amplifikována v reakci MLPA.

Posouvejte kurzor po gradientu množství DNA a uvidíte vliv daného množství DNA na Q-fragmenty v profilu píků

Posouvejte kurzor po gradientu množství DNA a uvidíte vliv daného množství DNA na Q-fragmenty v profilu píků.

Výška Q-fragmentů v profilu píků závisí na množství DNA přítomné v reakci MLPA.

Po přidání 50 ng (nebo více) vzorku DNA a při úspěšné MLPA reakci je počet Q-fragmentů mnohem nižší, než je počet ligovaných sond. V důsledku toho budou Q-fragmenty (téměř) neviditelné.

Při snížení množství DNA se počet ligovaných sond sníží a Q-fragmenty jsou viditelnější. Pokud v reakční směsi není žádná DNA, tak pouze Q-fragmenty jsou viditelné.

V normální MLPA reakci (vlevo) jsou Q-fragmenty nižší než 33% referenčního fragmentu

V normální MLPA reakci (vlevo) jsou Q-fragmenty nižší než 33% referenčního fragmentu.

Výška Q-fragmentů by měla být porovnána s referenčním fragmentem. Pokud bylo použito dostatečné množství DNA a ligační reakce byla dokončena, pak výška všech Q-fragmentů je nižší než 33% referenčního fragmentu.

Ujistěte se, že se přidáváte 50 - 100 ng DNA do MLPA reakce, aby se zabránilo vzniku vysokých Q-fragmentů


Ujistěte se, že se přidáváte 50 - 100 ng DNA do MLPA reakce, aby se zabránilo vzniku vysokých Q-fragmentů.

Toto je optimální množství DNA pro MLPA. Při použití tohoto množství DNA bude výška Q-fragmentů výrazně nižší než požadovaných 33% referenčního fragmentu.

Aby se minimalizoval vliv rozdílů v kvalitě vzorku na konečné výsledky, používejte podobné množství DNA pro každý vzorek v daném MLPA experimentu.

Všimněte si, že koncentrace DNA je často přeceňována, pokud je použita spektrální hustota. Nečistoty, jako je RNA a proteiny, také přispívají k absorbanci při 260 nm.

Neúspěšná ligační reakce může mít také za následek vysoké Q-fragmenty

Neúspěšná ligační reakce může mít také za následek vysoké Q-fragmenty.

Ve většině případů, vysoké Q-fragmenty ukazují na nedostatečné množství DNA. Nicméně, problémy s ligační reakcí také mohou být příčinou vysokých Q-fragmentů. Ligační reakce může selhat, je-li vzorek DNA depurinovaný přímo v nebo v blízkosti ligačního místa sondy MLPA.

Depurinace může mít velký vliv na výšku sond MLPA, zejména těch, které mají dvě ligační místa.

Depurinaci vzorku DNA může být zabráněno přidáním dostatečné pufrovací kapacity do vzorků

Depurinaci vzorku DNA může být zabráněno přidáním dostatečné pufrovací kapacity do vzorků.

Depurinace může nastat, když jsou vzorky špatně pufrovány a vystaveny dlouho vysoké teplotě (více než 10 minut), například během kroku denaturace v reakci MLPA.

Aby se zabránilo depurinaci, měly by vzorky obsahovat 5-10 mM Tris HCl, pH 8,0 – 8,5. Z tohoto důvodu, vždy rozpouštějte a řeďte vzorky DNA v pufru, jako je TE. Nikdy nepoužívejte vodu!

V případě, že není známo, zda je vzorek DNA zředěn ve vodě nebo v TE, doporučujeme přidat 50 mM Tris-HCl s pH mezi 8,0 a 8,5. Například pro reakci MLPA použijte směs 4 ul vzorku DNA a 1 ul 50 mM Tris-HCl pH 8,5.

3. D pro denaturaci – Denaturační fragmenty

D – fragmenty

MLPA sondy se mohou vázat pouze na jednovláknovou DNA

MLPA sondy se mohou vázat pouze na jednovláknovou DNA. Z tohoto důvodu je důležité, aby DNA byla zcela denaturována před hybdridizací sondy.

V případě, že DNA není úplně denaturovaná, sondy MLPA mohou mít problémy s vazbou na jejich cílové DNA. To způsobí, že signál sondy pro tyto sondy je nižší, případně připomínající deleci.

Protože neúplná DNA denaturace může vést k falešně pozitivním výsledkům, každý MLPA kit obsahuje dva denaturační fragmenty pro kontrolu úplnosti denaturace.

Posouvejte kurzor na různé části každého D-fragmentu a objeví se jejich popis

Posouvejte kurzor na různé části každého D-fragmentu a objeví se jejich popis.

D-fragmenty pracují přesně tak, jako "normální" MLPA sondy: obsahují levé a pravé oligo sondy, které obě musí hybridizovat na vzorek DNA a být ligovány, aby mohly být amplifikovány.

Oba D-fragmenty rozpoznávají cílovou sekvenci velmi bohatou na CpG ostrovy: oblasti DNA, které nejhůře denaturují.

V případě, že denaturace vzorku DNA byla neúplná, D-fragmenty budou mít nižší signál.

V reakci MLPA se správně denaturovanou DNA  (vlevo) je výška D-fragmentů podobná jako u referenčního fragmentu

V reakci MLPA se správně denaturovanou DNA  (vlevo) je výška D-fragmentů podobná jako u referenčního fragmentu.

Výška obou D-fragmentů by měla být porovnávána s výškou referenčního fragmentu. V případě, že výška obou D-fragmentů je nižší než 50% referenčního fragmentu, denaturace vzorku DNA byla neúplná.

Znečišťující látky ve vzorku DNA mohou způsobit neúplnou denaturaci

Znečišťující látky ve vzorku DNA mohou způsobit neúplnou denaturaci.

Za normálních okolností je 5 minutový denaturační krok při 98 stupních dostatečný pro úplnou denaturaci vzorku DNA. Nicméně, nečistoty ve vzorku DNA mohou denaturaci zhoršovat.

Znečišťující látky, jako jsou soli (NaCl, KCl), mohou způsobit neúplnou denaturaci v koncentraci vyšší než 40 mM, přičemž Mg a Fe ionty mohou vést k neúplné denaturaci při koncentracích již od 1 mM.

Obrázek nahoře ukazuje účinek různých koncentrací NaCl na výšku D-fragmentů a několik sond citlivých na koncentraci solí (označeny šipkami).

Denaturace může být zlepšena snížením účinku nečistot na reakci MLPA

Denaturace může být zlepšena snížením účinku nečistot na reakci MLPA.

Existují dva způsoby, jak snížit vliv nečistot na reakci MLPA:

  • Použití menšího množství DNA a to zředěním vzorku DNA
  • Provedení přečištění vzorku DNA

Když snížíme množství DNA v 5 ul  vzorku zředěním DNA, možné nečistoty budou rovněž sníženy. Použijte TE pro ředění vzorku. Dbejte na to, aby alespoň 50 ng DNA bylo použito v reakci MLPA.

Kliknutím na ikonu PDF získáte více informací o metodách čistění vzorků pro MLPA.

4. XX je žena a XY je muž

X- a Y- fragmenty


X a Y -fragmenty pomáhají detekovat náhodnou záměnu vzorků

X a Y -fragmenty pomáhají detekovat náhodnou záměnu vzorků.

Pro zvýšení detekce náhodné záměny vzorků, každý MLPA kit obsahuje alespoň dvě sondy pro detekci pohlavních chromozómů: specifickou sondu pro  X-chromozóm (100 nt) a specifickou sondu pro Y- chromozóm (105 nt).

Navíc, některé kity obsahují druhou Y-chromozóm specifickou sondu.
Podobně jako  D-fragmenty a "normální" MLPA sondy, X- a Y- fragmenty vyžadují přítomnost vzorku DNA a úspěšnou ligační reakci, aby byly viditelné.

V profilu píků lze X- a Y-fragmenty nalézt na pravé straně od D-fragmentů

V profilu píků lze X- a Y-fragmenty nalézt na pravé straně od D-fragmentů.

  • Ženský vzorek: pouze X-fragment (100 nt) je viditelný.
  • Mužský vzorek: jak X- (100 nt) tak Y-fragment (105 nt) jsou viditelné. Ve srovnání s ženským vzorkem, výška signálu X-fragmentu se sníží na polovinu.

X- a Y-fragmenty nemusejí být porovnávány s referenčním fragmentem. Jejich přítomnost v profilu píků je dostatečná pro analýzu pohlaví vzorku.


Věděli jste, že starší muži často ztrácejí svůj Y chromozóm v krevních buňkách?

Věděli jste?

Že starší muži často ztrácejí svůj Y chromozóm v krevních buňkách?

Je již dlouho známo, že Y chromozóm je důležitý pro určení pohlaví a produkci spermií, a že u starších mužů může zmizet z určitých typů buněk, včetně krevních buněk. V důsledku toho může signál Y-fragmentu chybět, pokud je mužský vzorek testován pomocí MLPA.

5. Coffalyser.Net

Analýza kontrolních fragmentů pro kvalitu MLPA v Coffalyser.Net

S programem Coffalyser.Net je interpretace kontrolních fragmentů pro kvalitu snadná

S programem Coffalyser.Net je interpretace kontrolních fragmentů pro kvalitu snadná.

Tabulka analýzy fragmentů v Coffalyser.Net udává barevně odlišené skóre kvality pro Q-fragmenty (DNA) a D-fragmenty (DD, pro DNA denaturaci) a ukazuje, zda X- a Y-fragmenty jsou přítomny v profilu píků.

POZOR:

  • Výsledky mohou být akceptovány bez přezkoumání.
  • S výsledky by se mělo zacházet opatrně, protože to může mít vliv na konečnou interpretaci.
  • Výsledek je nepřijatelný a vzorek by neměl být používán pro další intepretaci.

Otevřením vzorku v programu lze získat podrobné informace o kontrolních fragmentech pro kvalitu.

Otevřením vzorku ve Fragment Sample Results Explorer v Coffalyser.Net lze získat podrobné informace o kontrolních fragmentech pro kvalitu.

Ve Fragment Sample Results Explorer jsou uvedeny: skóre kvality, relativní poměry (ve srovnání s referenčním fragmentem) a absolutní hodnoty kontrolních fragmentů.

Přehráním videa se dozvíte, jak získat přístup k informacím o kontrolních fragmentech v Coffalyser.Net.

Coffalyser.Net varuje, když jsou příliš vysoké Q-fragmentyCoffalyser.Net varuje, když jsou příliš vysoké Q-fragmenty

Coffalyser.Net varuje, když jsou příliš vysoké Q-fragmenty.

V obou záložkách Fragment Analysis tab (sloupec DNA) a Fragment Sample Results Explorer jsou uvedeny skóre kvality pro Q-fragmenty:

V obou oknech bude varování, když jsou příliš vysoké Q-fragmenty:

  • Q-fragmenty < 33 % referenčního fragmentu
  • Q-fragmenty > 33 % referenčního fragmentu
  • Q-fragmenty > 50% referenčního fragmentu

Coffalyser.Net varuje, když jsou D-fragmenty příliš nízkéCoffalyser.Net varuje, když jsou D-fragmenty příliš nízké

Coffalyser.Net varuje, když jsou D-fragmenty příliš nízké.

V obou záložkách Fragment Analysis tab (sloupec DD) a Fragment Sample Results Explorer jsou uvedeny skóre kvality pro D-fragmenty.

V obou oknech bude varování, pokud jsou D-fragmenty příliš nízké.

  • 2 D-fragmenty > 50% referenčního fragmentu
  • 1 D-fragment < 50% referenčního fragmentu, další D-fragment > 50% referenčního fragmentu
  • 2 D -fragmenty < 50% referenčního fragmentu

Coffalyser.Net indikuje přítomnost X- a Y-fragmentu v profilu píkůCoffalyser.Net indikuje přítomnost X- a Y-fragmentu v profilu píků

Coffalyser.Net indikuje přítomnost X- a Y-fragmentu v profilu píků.

V obou záložkách Fragment Analysis tab (sloupec X a Y sloupec) a Fragment Sample Results Explorer je uvedena přítomnost X- a Y- fragmentu.

Na konci učebního modulu si můžete  v krátkém testu ověřit své znalosti o kontrolních fragmentech pro kvalitu MLPA.

Máte dotazy k e-learningovému kurzu? Napište nám

Položky označené hvězdičkou (*) jsou povinné.

Vaše osobní údaje nejsou nikde zveřejňovány a splňují požadavky GDPR.

Kontaktujte nás

BIOGEN PRAHA s.r.o.
Ke sv. Izidoru 2293/4A
140 00 PRAHA 4

Tel.: +420 241 401 693
Fax: +420 241 401 694
E-mail: biogen@biogen.cz

Novinky na e-mail

Vaše osobní údaje nejsou nikde zveřejňovány a splňují požadavky GDPR.