Úvod Magazín Metoda MLPA pro detekování specifické sekvence DNA

Metoda MLPA pro detekování specifické sekvence DNA

Zdrojem genetické variability v lidské DNA je variabilita v počtu kopií (Copy Number Variace - CNV), která také hraje také roli u řady onemocnění. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) je semi-kvantitativní metoda, využívaná pro stanovení relativního počtu kopií až 60 sekvencí DNA v jediné multiplexní PCR reakci. Společnost MRC-Holland vyrábí a prodává reagencie a širokou škálu MLPA kitů pro metodu MLPA. Tyto produkty mohou být společně použity k detekci delecí a duplikací ve vzorcích DNA.

Princip metody MLPA

Obrázek 1 zobrazuje, že princip MLPA testu je založen na amplifikaci (za použití jednoho páru primerů PCR) až 60 sond. Každá z nich detekuje specifickou DNA sekvenci o délce přibližně 60 nukleotidů. Po denaturaci DNA je ke vzorku přidána směs MLPA sond. Každá MLPA sonda se skládá ze dvou oligonukleotidů, které hybridizují k přilehlým cílovým sekvencím, aby mohly být spojeny do jedné sondy. Každá ze sond v MLPA kitu má jedinečnou délku amplikonu, nejčastěji v rozmezí od 130 do 500 nukleotidů.

V průběhu následné PCR reakce jsou všechny ligované sondy amplifikovány současně pomocí stejného PCR páru primerů. Jeden PCR primer je fluorescenčně značený, což umožňuje vizualizaci amplifikačních produktů během separace fragmentů. Separace je prováděna na přístroji kapilární elektroforézy, čímž se získá specifický elektroforeogram (Obrázek 2, vlevo). Relativní výška každého vrcholu (píku) individuálních sond ve srovnání s relativní výškou píků sond v různých referenčních vzorcích DNA odráží relativní počet kopií, které odpovídají cílové sekvenci ve vzorku. Výsledkem delece jedné nebo více cílových sekvencí je relativní snížení výšky píku (Obrázek 2, vpravo), zatímco zvýšení relativní výšky píku odráží duplikaci.

Obrázek 1. Princip MLPA metody

Princip MLPA metody

Obrázek 2.

A: Elektroforeogram testovaného vzorku (dole) je porovnán s profilem referenčního vzorku (nahoře) a ukazuje relativní pokles tří sond u testovaného vzorku (šipky).
B: Vypočtené poměry sond stejného testovaného vzorku (zobrazeno Softwarem Coffalyser.Net) po analýze těchto dvou vzorků: uspořádání sond podle chromozomální lokalizace ukazuje snížený počet kopií tří vedlejších sond v testovaném vzorku.

Elektroforeogram testovaného vzorku a vypočtené poměry sond

Analýza výsledků MLPA metody

Pro analýzu MLPA dat se používá software Coffalyser.Net, který je zdarma ke stažení z našeho webu (mlpa.cz). Software vybírá nejvhodnější metodu analýzy pro každý MLPA kit a následně nabízí rozsáhlou kontrolu kvality. Téměř všechny SALSA MLPA kity obsahují devět referenčních fragmentů (jak popisujeme v tabulce uvedené níže), které slouží pro kontrolu kvality fragmentů a pomáhají při řešení případných problémů.

Fragmenty pro interní kontrolu kvality

Název Délka Interpretace
92 nt měřítková sonda 92 Normální sonda, tvoří měřítko pro porovnání s dalšími fragmenty kontroly kvality.
Q-fragmenty 64, 70, 76, 82 Vysoké, pokud množství DNA je příliš nízké nebo se nezdařila ligace. Signál všech čtyř Q-fragmentů ≥ 33 % 92 nt kontrolního fragmentu → nedostatečné množství DNA.
D-fragmenty 88, 96 Nízké, v případě špatné denaturace vzorku DNA. Signál ≤ než 40% 92 nt kontrolního fragmentu → problémy s denaturací DNA.
X a Y fragmenty 100, 105 Kontroly pro záměnu vzorků1

1Jsou známy vzácné případy, kdy muži nemají Y specifickou sekvenci a ženy mají tuto Y sekvenci na X chromozómu.

Absolutní fluorescenci měřenou pomocí kapilární elektroforézy není možné použít přímo pro výpočet počtu kopií, protože je ovlivněna mnoha proměnnými. V první řadě fluorescence každé sondy musí být normalizována v každém vzorku, abychom mohli získat smysluplné výsledky. Je také třeba provést porovnání různých vzorků, abychom byli schopni zjistit, který vzorek má abnormální počet kopií. Z tohoto důvodu se MLPA normalizace skládá z 2 kroků: intra-vzorková normalizace (porovnání píků sond v rámci vzorku) a mezi-vzorková normalizace (porovnání relativních píků sond mezi vzorky.)

Normalizace v rámci vzorku

V každém vzorku se porovnávají píky jednotlivých sond s píky referenčních sond. Referenční sondy detekují sekvence, u kterých se očekává, že mají normální počet kopií ve všech vzorcích. Téměř všechny MLPA kity obsahují 8 nebo více referenčních sond umístěných na různých chromozómech.

Normalizace mezi vzorky

Finální poměry sond jsou určeny porovnáním relativních píků sond v testovaném vzorku DNA s píky sond všech referenčních vzorků. Je předpokládáno, že referenční vzorky budou mít normální počet kopií pro referenční i cílové sondy.

Profil píků testovaného vzorku DNA bez genomových abnormalit bude totožný s profilem referenčních vzorků: finální poměry sond stanovené v kroku 2 budou ~ 1,0. U heterozygotní delece budou poměry sond ~ 0,5. Tyto finální poměry sond můžeme také nazývat Kvocient dávky (Dosage Quotient - DQ).

Coffalyser.Net vypočítá DQ pro každou sondu v každém vzorku. Sondy jsou uspořádány podle chromozomální lokalizace pro správnou interpretaci, což také pomáhá při odhalování drobných změn, jako je mozaika. Následující tabulka uvádí vztahy mezi počtem kopií a typickou distribucí DQ (na základě velkého počtu vzorků testovaných v MRC-Holland).

Rozložení kvocientu dávky (DQ) Počet kopií – status
DQ = 0  0 kopie (homozygotní delece)
0.40 < DQ < 0.65 2 → 1 kopie (heterozygotní delece)
0.80 < DQ < 1.20 NORMÁLNÍ (identický s referenčními vzorky)
1.30 < DQ < 1.65 2 → 3 kopie (heterozygotní duplikace)
1.75 < DQ < 2.15 2 → 4 kopie (nebo 1 → 2 kopie)
Další ostatní hodnoty nejednoznačné výsledky


Interpretace výsledků MLPA

Informace uvedené v popisu produktu pro specifický MLPA kit jsou pro správnou interpretaci MLPA výsledků zásadní. Posouzení, zda jsou získané MLPA výsledky spolehlivé, vyžaduje dobrou znalost metody a testované aplikace. Metoda MLPA má určité limitace, které hodnotící osoba musí při interpretaci výsledků zohlednit.

U většiny aplikací jsou hlavní příčinou genetických defektů malé (bodové) mutace, z nichž většina nebude detekována MLPA. Metoda totiž nebude detekovat většinu inverzí, translokací, ani změny v počtu kopií, které leží mimo cílovou sekvenci. Změny (SNP, bodové mutace) v cílové sekvenci DNA sondy (až > 10 nt od vazebného místa) mohou způsobovat falešné delece. Tyto změny mohou snížit signál sondy buď blokací vazby sondy, nebo destabilizací vazby mezi sondou a cílovou DNA.

Změny v počtu kopií detekované jedinou sondou vždy vyžadují potvrzení jinou metodou. Kupříkladu sekvenování cílové sekvence sondy může ukázat, zda je snížený signál sondy způsoben mutací, nebo polymorfismem. Pro potvrzení delece celého exonu jsou často používány metody „long-range“ PCR a qPCR. V neposlední řadě ne všechny delece a duplikace zjištěné MLPA jsou patogenní. U některých genů, jako je DMD (Duchennova muskulární dystrofie), vede delece ve čtecím rámci k mírnému nebo žádnému onemocnění. Duplikace jednoho nebo více exonů však může porušit kopii tohoto genu, což může vést k onemocnění, zatímco kompletní genová duplikace nemusí být patogenní. V některých případech je pro správnou interpretaci výsledků nezbytná analýza rodičovských vzorků.

Kity pro metodu MLPA

Firma MRC- Holland, jejímž českým zástupcem je naše firma Biogen, nabízí stovky kitů pro skríning kongenitálních a dědičných chorob či syndromů, pro analýzu metylace a profilování nádorů.

Kity můžeme rozdělit do následujících kategorií:

Prenatální a postnatální

Tato kategorie zahrnuje kity pro hledání příčin novorozenecké nesyndromové mentální retardace. Některé kity obsahují sondy pro všechny subtelomerické oblasti (kit P036/P070) a centromery (kit P181/P182). V některých případech, fenotypové znaky poukazují na zapojení určitého genu nebo chromozomální oblasti. Nabízíme také kity, které umožňují skríning různých syndromů jednotlivě nebo současně (P245 mikrodeleční syndromy).

Neurogenetika a mentální retardace

Kategorie obsahuje kity pro skríning specifických syndromů, projevujících se mentální retardací (například Angelmanovým syndromem, Downovým syndromem, Pataovým syndromem, Edwardsovým syndromem a podobně).

Dědičné nádory

Kity pro skríning dědičných nádorů jako je karcinom prsu, Fanconiho anémie, familiární MDS-AML, familiární juvenilní polypóza, retinoblastom a další.

Charakterizace nádorů

Pro tento účel se využívají kity určené pro analýzu DNA odvozené z nádorů. Jsou to například kity pro akutní lymfoblastickou leukémii, chronickou myeloidní leukémii, kolorektální nádor, nádor žaludku, gliom a podobně.

Farmakogenetika

Kategorie nabízí kity pro studium dědičně podmíněné variability v odpovědi organismu na léky. Patří sem například kity obsahující sondy pro chemokiny, defensiny, cytochromy P450 a podobně.

Metylační analýza

Kity v této kategorii jsou určené pro studium metylace u různých onemocnění jako je syndrom fragilního X, Prader Willi syndrom nebo pro analýzu metylace CpG ostrovů a tumor-supresorových genů.

Různá genetická onemocnění

Kity pro odhalování změn v počtu kopií u různých genetických onemocnění, například mikrodelece/duplikace v oblasti 22q11 způsobující různé syndromy jako DiGeorgův syndrom, syndrom kočičího oka, mutace v genech PSEN1, PSEN2 a APP vyskytující se u pacientů s Alzheimerovou chorobou a tak dále.


Potřebujete vybavení pro metodu MLPA? Napište nám

Položky označené hvězdičkou (*) jsou povinné.

Vaše osobní údaje nejsou nikde zveřejňovány a splňují požadavky GDPR.

Kontaktujte nás

BIOGEN PRAHA s.r.o.
Ke sv. Izidoru 2293/4A
140 00 PRAHA 4

Tel.: +420 241 401 693
Fax: +420 241 401 694
E-mail: biogen@biogen.cz

Novinky na e-mail

Vaše osobní údaje nejsou nikde zveřejňovány a splňují požadavky GDPR.