Úvod Magazín MLPA ® OBECNÝ PROTOKOL

MLPA ® OBECNÝ PROTOKOL: Návod k použití

Tento protokol obsahuje informace, které jsou nezbytné pro získání spolehlivých výsledků MLPA a musí se číst v plném rozsahu a používat v kombinaci s příslušným popisem produktu pro specifický MLPA kit.

SALSA® MLPA® kit reagencií a Coffalyser.Net analyzační software jsou registrovány pro in vitro diagnostiku (IVD), ale jen v určitých zemích. Ve všech ostatních zemích jsou MLPA výrobky určeny pouze pro výzkumné účely (RUO). Pokud používáte MLPA pro diagnostické účely, je nezbytné používat kit registrovaný pro IVD v kombinaci s SALSA® MLPA® kitem reagencií a Coffalyser.Net softwarem pro analýzu dat. Informace o registraci IVD v konkrétním státě lze nalézt ve specifickém popisu produktu příslušného kitu.

1. POUŽITÉ SYMBOLY
2. POUŽITÍ
3. PRINCIP MLPA TESTU
4. OBSAH SALSA® MLPA® KITŮ A PODMÍNKY SKLADOVÁNÍ
5. POKYNY PRO NASTAVENÍ TESTU
6. MLPA REAKCE - DNA DETEKCE/KVANTIFIKACE
7. SEPARACE FRAGMENTŮ POMOCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTOFORÉZY
8. KONTROLA KVALITY MLPA A ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ
9. ANALÝZA DAT
10. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

1. POUŽITÉ SYMBOLY

2. POUŽITÍ

Variabilita v počtu kopií (Copy Number Variace - CNV) je významným zdrojem genetické variability v lidské DNA a hraje roli u řady onemocnění. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) je semi-kvantitativní metoda, která je používána pro stanovení relativního počtu kopií až 60 sekvencí DNA v jediné multiplexní PCR reakci. Firma MRC-Holland vyrábí a prodává reagencie pro MLPA a širokou škálu MLPA kitů. Společně tyto produkty mohou být použity k detekci delecí a duplikací ve vzorcích DNA. Podrobnosti o použití jsou uvedeny v popisu produktu pro specifický SALSA MLPA kit.

3. PRINCIP MLPA TESTU

Jak je uvedeno na Obrázku 1, princip MLPA testu je založen na amplifikaci (za použití jednoho páru primerů PCR) až 60 sond, z nichž každá detekuje specifickou DNA sekvenci o délce přibližně 60 nukleotidů. Výsledkem reakce MLPA je soubor jedinečných PCR amplikonů přibližně v rozmezí 64-500 nt, které jsou odděleny kapilární elektroforézou. Po denaturaci DNA se přidá ke vzorku směs MLPA sond. Obecně se každá MLPA sonda skládá ze dvou oligonukleotidů, které musí hybridizovat okamžitě k přilehlým cílovým sekvencím, aby mohly být spojeny do jedné sondy. Každá sonda v MLPA kitu má jedinečnou délku amplikonu, obvykle v rozmezí od 130 do 500 nt.

V průběhu následné PCR reakce, všechny ligované sondy jsou amplifikovány současně pomocí stejného PCR páru primerů. Jeden PCR primer je fluorescenčně značený a umožňuje tak vizualizaci amplifikačních produktů během separace fragmentů.

 Obrázek 1. MLPA test

Separace se provádí na přístroji kapilární elektroforézy, čímž se získá specifický elektroforeogram (Obrázek 2, nahoře). MLPA je relativní metoda: pouze relativní rozdíly mohou být detekovány porovnáním MLPA profilu vrcholů (píků) mezi vzorky DNA. Zahrnutí referenčních vzorků ve stejném běhu je proto zásadní (viz 9. ANALÝZA DAT). Relativní výška každého píku jednotlivých sond ve srovnání s relativní výškou píků sond v různých referenčních vzorcích DNA odráží relativní počet kopií odpovídající cílové sekvence ve vzorku. Delece jedné nebo více cílových sekvencí vede k relativnímu snížení výšky píku (Obrázek 2, dole), zatímco zvýšení relativní výšky píku odráží amplifikaci.

Obrázek 2: Porovnání profilů MLPA dat

Nahoře: Elektroforeogram testovaného vzorku A (vpravo) je porovnáván s elektroforeogramem referenčních vzorků (vlevo) ukazující relativní pokles dvou sond v testovaném vzorku A (zakroužkované červeně).

Dole

Vypočtené poměry sond testovaného vzorku A versus referenční vzorky, jak je to zobrazeno softwarem Coffalyser.Net. Uspořádání sond podle chromozomální lokalizace odhaluje heterozygotní deleci v testovaném vzorku (červené puntíky).
T: cílové sondy, R: referenční sondy

4. OBSAH SALSA® MLPA® KITŮ A PODMÍNKY SKLADOVÁNÍ

4.1. KATALOGOVÁ ČÍSLA KITŮ REAGENCIÍ

4.2. OBSAH KITŮ REAGENCIÍ

4.3. MLPA SMĚSI PRO SPECIFICKÉ APLIKACE

* Směsi jsou určeny k použití pouze v kombinaci s reagenčními kity SALSA MLPA.
#Typ SD (referenční, binningová a umělá duplikovaná DNA) a dostupnost závisí na směsi.
≠ Objemy a složky jsou závislé na typu SD.

4.4. SKLADOVÁNÍ A STABILITA

Všechny součásti kitu SALSA MLPA musí být uloženy hned po dodání mezi -25 °C a -15 °C, musí být chráněny před světlem a v původním obalu. Pokud se skladují za doporučených podmínek, je zaručena trvanlivost do datumu expirace, a to i po otevření. Přesné datum expirace, většinou nejméně 1 rok po doručení, je uvedeno na každé lahvičce. Produkty by neměly být vystaveny více než 25 zmrazovacím-rozmrazovacím cyklům.

Žádná ze složek kitu není odvozena od lidí, zvířat nebo patogenních bakterií. Žádná ze složek není přítomna v nebezpečných koncentracích, jak je definováno v Hazard Communication Standards. Bezpečnostní list není nutný pro tyto produkty: žádný z přípravků neobsahuje nebezpečné látky (podle směrnice (EC) No 1272/2008 [EUGHS/CLP] a pozměňovací návrhy) v koncentracích, které vyžadují distribuci bezpečnostního listu (podle směrnice (EC) No 1272/2008 [EUGHS/CLP] a 1907/2006 [REACH] a pozměňovací návrhy). Pokud dojde k vylití, omyjte vodou a postupujte dále podle místních pravidel.

5. POKYNY PRO NASTAVENÍ TESTU

5.1. MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ KITU

  • Ultračistá voda
  • TE 0.1 (10 mM Tris-HCl, pH 8,2 + 0,1 mM EDTA)
  • Termocykler s vyhřívaným víkem (99-105 °C) a standardní laboratorní vybavení
  • 0,2ml PCR zkumavky, stripy nebo destičky
  • Vybavení pro kapilární elektroforézu (viz. dále)
  • Analytický software Coffalyser.Net a uživatelská příručka a Coffalyser list

5.2. BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ A UPOZORNĚNÍ

  • Některé produkty SALSA MLPA prodávané společností MRC-Holland jsou registrovány pro použití in vitro diagnostiky (IVD) ve specifických zemí. Ve všech ostatních zemích jsou produkty MLPA určené pouze pro výzkumné účely (RUO).
  • Vždy se důkladně seznamte s nejnovější verzí popisu příslušného kitu a s MLPA obecným protokolem. Striktně dodržujte tento protokol.
  • Pouze pro profesionální použití. Výkon testu je závislý na znalosti obsluhy a dodržování procesních pravidel. Test by měl být proveden odborníky vyškolenými v molekulárních technikách. Osoba odpovědná za interpretaci výsledků by měla být informována o nejnovějších vědeckých poznatcích o dané aplikaci a být si vědoma limitací metody MLPA, které mohou vést k nesprávným výsledkům.
  • Interní validace každé MLPA aplikace je nezbytná; měla by obsahovat alespoň 16 normálních vzorků DNA. Validace by měla vykazovat směrodatnou odchylku <0,10 pro každou sondu (pokud v popisu produktu není uvedeno jinak). Vzorky použité pro validaci by měly být reprezentativní vzorky používané v každodenní praxi.
  • Falešné pozitivní nebo negativní výsledky mohou být způsobeny různými faktory, včetně:
    • Změny sekvencí. Viz 5.3 Limitace metody.
    • Nečistoty v testovaných nebo referenčních vzorcích DNA, včetně NaCl nebo KCl (> 40 mM) a jiných solí, fenolu, ethanolu, heparinu, EDTA (> 1,5 mM) a Fe
    • Depurinace DNA vzorku během počáteční tepelné inkubace při teplotě 98 °C. To může nastat, když má vzorek nedostatečnou pufrovací kapacitu (vzorek rozpuštěný ve vodě namísto TE). Minimálně 5 mM Tris pH 8,0 ve vzorku DNA je požadováno.
    • Problémy s denaturací DNA, které způsobily nedostupnost templátu DNA (jeho části) pro MLPA sondy. Některé způsoby purifikace DNA, např. Qiagen EZ1 má za následek vysokou koncentraci soli v DNA vzorku. Oblasti extrémně bohaté na GC nejsou denaturovány při 98 °C, pokud je přítomno více než 40 mM NaCl nebo KCl.
    • Použití nesprávného množství DNA (viz 5.4 Zpracování vzorku).
    • Použití nedostatečných nebo nevhodných referenčních vzorků (viz 5.5. Výběr referenčních a dalších kontrolních vzorků).
    • Nesprávné míchání enzymových roztoků, např. míchání nedostatečně nebo příliš energické.
    • Odpařování během hybridizace přes noc, což způsobuje zvýšenou koncentraci soli a silnou sekundární strukturu DNA vzorku. To může zabránit tomu, aby se některé sondy vázaly na své cílové sekvence.
    • Kontaminace během reakce MLPA nebo elektroforézy s jinými PCR produkty.
    • Problémy při kapilární elektroforéze, které vedou k příliš nízkým píkům nebo píkům mimo měřítko.
    • Problémy při analýze dat. Pouze Coffalyser.Net v kombinaci s nejnovější verzí Coffalyser listu pro daný kit by měl být použit. Používání jiného softwaru může vést k nesprávným výsledkům.
    • Nesprávná interpretace výsledků kvůli nedostatečné znalosti o dané aplikaci nebo genu (genech).
    • Nedostatečná znalost klinického účinku zjištěné genetické aberace. Ne všechna delece a duplikace detekované MLPA jsou patogenní.
  • Abnormality zjištěné MLPA by měly být vždy potvrzeny nezávislou metodou. Změny počtu kopií zjištěné jedinou sondou vyžadují vždy validaci.

5.3. LIMITACE METODY

  • U většiny aplikací MLPA jsou hlavní příčinou většiny genetických defektů malé (bodové) mutace, z nichž většina nebude detekována MLPA sondami.
  • MLPA nezjistí žádné změny, které leží mimo cílovou sekvenci sondy a nezjistí počet kopií neutrálních inverzí nebo translokací. I když MLPA nezjistila žádnou aberaci, zůstává možnost, že existují biologické změny v tomto genu nebo v chromozomální oblasti, ale zůstávají nedetekovány.
  • Změny (např. SNP, bodové mutace, malé indels) v cílové sekvenci detekované sondou mohou způsobit falešné pozitivní výsledky. Mutace / SNP (i když > 20 nt od vazebního místa sondy) může snížit signál sondy, a to zabráněním ligace oligonukleotidových sond nebo destabilizací navázání oligonukleotidové sondy na DNA vzorek.

5.4. PŘÍPRAVA VZORKU

  • Použijte celkové množství 50 - 250 ng (optimální 50 -100 ng, pokud není uvedeno jinak v popisu daného produktu) lidské DNA v objemu 5 ul3 pro každou reakci MLPA4. Pokud je to nutné, mohou být vzorky DNA koncentrovány srážením ethanolem a glykogen (Roche 901393) může být použit jako nosič. Více informací naleznete na mlpa.com.
  • MLPA je citlivější na znečišťující látky než jednoduché monoplexní PCR. Znečišťující látky z DNA extrakce (uvedené v 5.2) mohou ovlivnit výkon MLPA.
  • Chcete-li minimalizovat vliv kontaminant, ujistěte se, že metoda extrakce, typ tkáně, koncentrace DNA a příprava jsou stejné u testovaných i referenčních vzorků.
  • Metoda purifikace by neměla zanechat vysokou koncentraci kontaminant jako jsou soli. Nepoužívejte Qiagen M6, M48 a M96 systémy pro izolaci DNA (vysoká koncentrace solí). Pro Qiagen EZ1, používejte pouze QIAGEN dodatkový protokol pro použití Third Wave Invader® testů (viz mlpa.com).
  • Firma MRC-Holland testovala a doporučuje vám následující metody extrakce:
  • Qiagen Autopure LS (automatizovaný) a QIAamp DNA mini/midi/maxi kit (manuální)
  • Promega Wizard Genomic DNA Purification kit (manuální)
  • Vysolování (manuální)
  • Jelikož heparin zkresluje MLPA reakci, heparinizovaná krev může být použita pouze v kombinaci s MLPA, pokud je vzorek purifikován metodou (například NucleoSpin gDNA Clean-up XS), která je schopná odstranit kontaminaci heparinem.
  • DNA vzorky by měly obsahovat 5 -10 mM Tris pufru s pH 8,0 až 8,5, aby se zabránilo depurinaci během počáteční denaturace při 98 °C. Například rozpusťte vzorek DNA v TE 0.1 (10 mM Tris-HCl pH 8,2 + 0,1 mM EDTA). Pokud je vám známo, že je přítomno nedostatečné množství pufru, přidejte Tris-HCl: 4μl vzorek DNA + 1 ul 50 mM Tris-HCl pH 8,5.
  • Koncentrace EDTA ve vzorcích nesmí být vyšší než 1,5 mM. Vzorek DNA by neměl být koncentrován odpařením nebo SpeedVac, neboť to vede k velmi vysoké koncentraci EDTA.
  • V případě pochybností o kvalitě DNA: a) použijte pouze 50 ng vzorku DNA; b) přečistěte kontaminované vzorky pomocí srážení ethanolem nebo kitem založeným na oxidu křemičitém;
  • Inkubace s RNAzou je nezbytná pouze při vyšetření genů, které jsou vysoce exprimovány ve studované tkáni. Např. HBA, HBB v krevních vzorcích; (mitochondriální) ribozomální RNA geny (všechny tkáně).
  • V některých případech může SALSA Sample Stabilizing Solution (RUO) (S4: SMR04, SMR45) zlepšit kvalitu reakce MLPA. S4 obsahuje několik složek, které snižují účinek nečistot ve vzorku DNA. Viz S4 popis produktu na adrese www.mlpa.com pro více informací.
  • DNA z celogenomové amplifikační reakce (WGA) není vhodná pro MLPA, protože její amplifikace je zkreslená.

Nikdy nepoužívejte více než 5 μl vzorku DNA na reakci. Použití více než 5 μl DNA snižuje koncentraci sondy a soli. To snižuje rychlost hybridizace a stabilitu vazby sond MLPA na vzorek DNA.

Měření optické hustoty (260 nm) často nadhodnocuje koncentraci DNA, např. kvůli kontaminaci RNA. Zda množství DNA bylo dostatečné, lze odhadnout na základě Q-fragmentů, jak je vysvětleno v bodě 8.1.

5.5. VÝBĚR REFERENČNÍCH A DALŠÍCH KONTROLNÍCH VZORKŮ

Referenční vzorky. Referenční vzorky by měly být zahrnuty v každém MLPA experimentu. Drobné rozdíly v experimentálním provedení mohou mít vliv na MLPA profil píků. Porovnávejte pouze vzorky, které a) jsou součástí stejného MLPA experimentu, b) testujete stejnou šarží kitu.

Více referenčních vzorků je potřeba pro odhad reprodukovatelnosti každé sondy v rámci každého běhu MLPA. Minimální počet jsou 3 různé referenční vzorky na jeden MLPA běh. Při testování > 21 vzorků: přidejte jeden referenční vzorek na 7 dalších testovaných vzorků. Referenční vzorky by měly být rozděleny náhodně na destičce, aby se minimalizovala variabilita.

Výběr referenčních vzorků. Referenční vzorky jsou vzorky DNA, u nichž se očekává, že jejich sekvence mají normální počet kopií a jsou získané od zdravých jedinců / tkání. Referenční vzorky by měly být co možná nejpodobnější testovaným vzorkům ve všech ostatních aspektech (viz 5.4). U tkání fixovaných formalínem a zalitých v parafinu by měly být referenční vzorky získané z podobně upravených zdravých tkání. Ne všechny kity jsou vhodné pro použití s DNA extrahovanou z materiálu FFPE. Zkontrolujte popis produktu daného kitu pro vhodné typy tkání.

Komerční DNA. V případě pochybností o kvalitě vzorku, zahrňte do testu jeden nebo více komerčních vzorků DNA pro porovnání. Doporučujeme Promega Cat Nr G1471 DNA muž a G1521 DNA žena. Komerční DNA by měly být použity pouze jako kontrola pro ověření kvality vzorku a neměly by být použity jako referenční vzorky.

Kontrola bez DNA. Každý běh MLPA musí zahrnovat kontrolní vzorek bez DNA: nahraďte 5 ul DNA pufrem TE 0,1 (10 mM Tris-HCl pH 8,2 + 0,1 mM EDTA) pro kontrolu kontaminace TE, MLPA činidel nebo činidel z elektroforézy a kapilár.

Pozitivní kontrolní vzorky. Zahrnutí pozitivních kontrol do testu se doporučuje, pokud je to možné. Při použití DNA z buněčné linie mějte na vědomí, že může obsahovat další změny v počtu kopií, vč. kompletních chromozomálních zisků / ztrát. MRC-Holland neposkytuje pozitivní vzorky.

Seznam komerčně dostupných pozitivních vzorků je k dispozici na webu MLPA.

Alikvotujte přesně/pečlivě referenční/kontrolní vzorky a uchovávejte je při -20 °C. Kontaminace mikroorganismy může zhoršit kvalitu vzorků, které se skladují delší dobu při teplotě 4 °C.

6. MLPA REAKCE - DNA DETEKCE/KVANTIFIKACE

6.1. POZNÁMKY – čtěte před provedením (1. den)

  • Použijte kalibrovaný termocykler s vyhřívaným víkem (99 - 105 °C).
  • Po použití skladujte všechny reagencie při teplotě mezi -25°C až -15°C.
  • Vždy vortexujte rozmražené pufry a sondy před použitím. MLPA pufr je obvykle ve zmrazeném stavu při teplotě -20 °C, ale může zůstat kapalný vzhledem k jeho vysoké koncentraci solí.
  • Centrifugujte všechny MLPA zkumavky několik sekund před použitím, neboť kapky roztoků mohou zůstávat na víčku.
  • Enzymové roztoky obsahují 50% glycerol a zůstávají tekuté při doporučené teplotě skladování. Nikdy nevortexujte roztoky obsahující enzymy. Master mixy, které obsahují enzymy, by měly být míchány jemně pipetováním nahoru a dolů. Pokud viskózní roztok enzymu není správně smíchán s pufrem, získáte nespolehlivé výsledky! Pokud se roztok enzymu míchá příliš intenzivně, dochází k inaktivaci enzymu. Při přípravě master mixů vždy přidávejte enzymy poslední.
  • Chcete-li minimalizovat variabilitu mezi vzorky, připravte si dostatečně velký objem master mixu. Přidejte 5-10 % objemu, aby bylo možné eliminovat chyby pipetování.
  • Je doporučeno připravit master mixy (Ligase-65 Master Mix a Polymerase Master Mix ) těsně před použitím při pokojové teplotě (RT). Pokud master mixy připravujete více než 1 hodinu před použitím, uložte je na led nebo při teplotě 4°C. Master mixy by měly být ohřáté na RT před přidáním k MLPA reakcím. Velké snížení teploty kvůli přidání velmi studeného ligazové master mixu může vést ke zvýšení nespecifických píků v reakci bez DNA.
  • Při testování velkého počtu vzorků použijte vícekanálovou pipetu, aby se zabránilo nadměrnému odpařování.

6.2. PROGRAM TERMOCYKLERU PRO MLPA REAKCI

Poznámka: Tento termocyklový program by měl být dodržen, pokud není uvedeno jinak v popisu produktu pro specifický kit.

6.3. DENATURACE DNA (1. den)

  • Označte 0,2 ml zkumavky, stripy nebo destičky.
  • Přidejte 5 ul vzorku DNA (50 až 250 ng, 50 až 100 ng, je optimální) do každé zkumavky. Použijte TE pro " kontrolu bez DNA".
  • Umístěte PCR mikrozkumavky do termocykleru; spustěte na termocykleru MLPA program (viz 6.2.). Denaturujte vzorek DNA 5 minut při 98 °C; zchladtě vzorky na 25 °C před vyjmutím zkumavek z termocykleru.

6.4. HYBRIDIZACE (1. den)

  • Vortexujte MLPA pufr a MLPA sondy před použitím.
  • Přípravte hybridizační master mix, který obsahuje na každou reakci: 1,5 ul MLPA pufru (žluté víčko) + 1,5 ul sond (černé víčko). Promíchejte dobře hybridizační master mix pipetováním nebo třepáním.
  • Po denaturaci DNA přidejte 3 ul hybridizačního master mix do každé zkumavky. Dobře promíchejte pipetováním nahoru a dolů.
  • Pokračujte v programu v termocykleru: inkubace po dobu 1 min při 95 °C, pak 16-20 hodin při teplotě 60 °C.

6.5. LIGACE (2. den)

  • Vortexujte oba (dva) ligázové pufry před použitím.
  • Připravte si Ligase-65 master mix. Pro každou reakci smíchejte: 25 ul dH2O + 3 ul Ligase Buffer A (průhledné víčko) + 3 ul Ligase Buffer B (bílé víčko). Zahřejte Ligase-65 enzym zkumavku 10 sec v ruce, aby se snížila viskozita. Pak přidejte 1 ul Ligase-65 enzymu (zelené víčko). Dobře promíchejte jemným pipetováním nahoru a dolů. Nikdy roztoky enzymů nevortexujte.
  • Pokračujte v programu v termocykleru: pauza při 54 °C.
  • Když je termocykler při 54 °C, a zatímco jsou vzorky v termocykleru, přidejte 32 ul ligázového master mix do každé zkumavky. Promíchejte jemně pipetováním nahoru a dolů.
  • Pokračujte v programu v termocykleru: 15 min inkubace při 54 °C (pro ligaci); 5 min při 98 °C pro tepelnou inaktivaci enzymu Ligáza-65. Pauza při teplotě 20 °C. V tomto okamžiku mohou být zkumavky vyjmuty z termocykleru.

6.6. PCR REAKCE (2. DEN)

  • Vortexujte SALSA PCR primery.
  • Připravte polymerázový master mix. Pro každou reakci smíchejte: 7,5 ul dH2O + 2 ul SALSA PCR směsi primerů (hnědé víčko Ohřejte polymerázu po dobu 10 sekund v ruce kvůli snížení viskozity. Pak přidejte 0,5 ul SALSA Polymerase (oranžové víčko). Dobře promíchejte pipetováním nahoru a dolů; nikdy nevortexujte.
  • Při pokojové teplotě, přidejte 10 ul polymerázového master mixu do každé zkumavky. Promíchejte jemně pipetováním nahoru a dolů. Vložte zkumavku přímo do termocykleru a pokračujte v programu; 35 cyklů 30 sekund 95 °C; 30 sekund 60 °C; 60 sekund 72 °C. Závěrečná 20 min inkubace při 72 °C; pauza při teplotě 15 °C.
  • Po skončení PCR reakce, neotvírejte zkumavky v místnosti s termocyklerem. Aby se zabránilo kontaminaci, použijte jiné mikropipety pro míchání MLPA reakce a manipulaci s produkty MLPA PCR.
  • PCR produkty mohou být skladovány při teplotě 4 °C po dobu 1 týdne. Delší dobu skladujte produkty mezi -25 °C / -15 °C. Jelikož fluorescenční barvy jsou citlivé na světlo, skladujte PCR produkty v tmavé krabičce nebo zabalené do hliníkové fólie.

7. SEPARACE FRAGMENTŮ POMOCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTOFORÉZY

7.1. POZNÁMKY - ČTĚTE PŘED PROVEDENÍM

  • Velikost standardů, podmínky běhu, polymer, fluorescenční barvivo a objem reakce MLPA PCR závisí na typu přístroje. Používejte standardní nastavení na vaší kapilární elektroforéze, které je vhodné pro danou aplikaci, polymer a délku kapiláry. Nastavení přístroje může vyžadovat optimalizaci pro optimální separaci fragmentů MLPA.
  • Použití staré kapiláry nebo polymeru má nepříznivý vliv na výsledky MLPA. Vyměňujte kapiláry a polymer pravidelně podle pokynů výrobce. Kvalita polymeru se rychle zhoršuje po delší době při teplotě > 25 ° C. Pokud jsou píky velikostních standardů nízké a široké, pak se obvykle zhoršila kvalita kapilár nebo polymeru.
  • Formamid může být kyselý. To může vést k depurinaci a fragmentaci DNA po zahřátí. Používejte kvalitní formamid a skladujte ho při -20 °C.
  • V případě že jsou všechny MLPA píky nízké, nepřidávejte další MLPA PCR produkt do vstřikované směsi! Přidáním více PCR produktu se zvyšuje koncentrace soli v injekční směsi, která konkuruje s DNA pro injekci. Pokud chcete zvýšit výšku píků, zvyšte čas vstřikování/napětí. Žádný pík by neměl být mimo měřítko! (viz.7.3.)
  • Vytvořte nový manuální bin set v Coffalyser.Net, kdykoli používáte jinou a) šarži kitu MLPA; b) velikostní standardy; c) zařízení pro kapilární elektroforézu nebo d) nastavení pro běh; e) typ polymeru nebo f) délku kapilár.

7.2. VYBAVENÍ A REAGENCIE, KTERÉ NENÍ DODÁVÁNO

  • Přístroj pro kapilární elektroforézu. Kapilární elektroforetické přístroje, které nepoužívají denaturační podmínky, jako je QIAxcel, nelze použít v kombinaci s SALSA MLPA.
    • Beckman: Softwarový balík GeXPo
    • Applied Biosystems: Standardní software pro sběr dat (Beckman Coulter nebo Applied Biosystems)
  • Vysoce kvalitní formamid (např. Hi-Di Formamide, Applied Biosystems)

Značené velikostní standardy

  • Beckman: CEQ™ DNA Size Standard Kit - 600
  • Applied Biosystems: GeneScan™ 500 LIZ® / ROX™ (preferovaný; povinný pro použití s IVD registrovanými kity), GeneScan 600 LIZ®, GeneScan 500 TAMRA ™

Polymery

  • Beckman: GenomeLab ™ Linear Polyacrylamide (LPA) denaturační gel 
  • Applied Biosystems: doporučujeme POP-4 nebo POP-7. POP-6 se nedoporučuje, protože má vysoké rozlišení. SeqStudio POP-1 je integrován do kartridge.

7.3. SPECIFIKACE ELEKTROFORÉZY

a Nikdy nepoužívejte více než 10% produktu PCR ve vstřikovací směsi.
b V případě potřeby snižte objem velikostních standardů.
c Pro ABI-3500: z výchozího nastavení zkraťte napětí běhu na 15 kV a prodlužte dobu běhu o 25%.
d  Krátké zahřátí injekční směsi je doporučenou před provedením kapilární elektroforézy.

Níže uvedená tabulka uvádí optimální, minimální a maximální rozsahy signálů pro kapilární elektroforézy. Pokud je signál mimo tyto hodnoty, je třeba provést optimalizaci nastavení analýzy fragmentů. Navíc, pokud signál spadá mimo optimální rozsah, lze získat falešné výsledky.

8. KONTROLA KVALITY MLPA A ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ

Pro analýzu MLPA dat použijte Coffalyser.Net software, který je volně ke stažení z mlpa.com. Coffalyser.Net software poskytuje kvalitní výsledky pro každou reakci a pomáhá při interpretaci kontrolních fragmentů, které jsou zahrnuty v každém kitu SALSA MLPA.

8.1. MLPA KONTROLNÍ FRAGMENTY KVALITY

MLPA interní kontrolní fragmenty kvality musí být zkontrolovány, aby byly zajištěny minimální požadavky na kvalitu MLPA!

Kity MLPA obsahují kontrolní fragmenty kvality, které signalizují problémy, které mohou ovlivnit výsledky MLPA. Vyhodnoťte kvalitu reakce MLPA včetně kontrolních fragmentů kvality s použitím níže uvedeného vývojového diagramu (viz 8.4). Pouze data, která splňují požadavky na kvalitu, jsou vhodné pro výpočet výsledku MLPA. V případě potřeby opakujte kapilární elektroforézu nebo reakci MLPA.

Wizard E-learning moduly pro MLPA kontrolní fragmenty kvality a odstraňování problémů MLPA jsou k dispozici online na webu MLPA.

Téměř všechny směsi sond (kity) SALSA MLPA obsahují devět kontrolních fragmentů, jak je popsáno níže:

Název Délka Interpretace
Benchmark fragment 92 Standard pro porovnání s dalšími kontrolními fragmenty kvality.
Q-fragmenty 64, 70, 76, 82 Vysoké, pokud množství DNA je příliš nízké nebo se nezdařila ligace. Medián signálů všech 4 Q-fragmentů ≥33% 92nt benchmark fragmentu – nedostatečné množství DNA nebo se nepodařila ligace. Např. Obrázek 3A a 3B.
D-fragmenty 88,96 Nízké, v případě špatné denaturace vzorku DNA. Signál ≤ 50% 92nt benchmark fragmentu – problémy s denaturací. Např. Obrázek 4B a 4C.
X a Y fragmenty 100,105 Kontroly pro záměnu vzorků5.

5 Jsou známy vzácné případy, kdy muži nemají Y specifickou sekvenci a ženy mají tuto Y sekvenci na X chromozómu.

Q-fragmenty

Čtyři kvantitativní fragmenty (Q-fragmenty, v délce 64-70-76-82 nt) měří zda bylo přidáno dostatečné množství DNA, a zda byla ligace úspěšná. Q- fragmenty nepotřebují hybridizaci nebo ligaci, aby byly amplifikovány při PCR. Čím více DNA se přidá, tím nižší jsou Q-fragmenty; viz Obrázek 3.

Všechny čtyři Q-fragmenty jsou vysoké: nedostatečné množství použité DNA nebo neproběhla ligace!

Obrázek 3: Vliv množství DNA na Q- fragmenty. Čím více DNA je použito, tím nižší jsou Q-fragmenty. A. 5 ng, B. 10 ng, C. 50 ng DNA.

D-fragmenty

Dva DNA denaturační fragmenty (D-fragmenty, 88 a 96 nt) detekují sekvence v mimořádně silných CpG ostrovech. CpG ostrovy mají vysoký obsah GC a je obtížné je denaturovat. Pokud jsou 88 a 96 nt fragmenty nízké (< 50% z 92 nt benchmark fragmentu), poukazuje to na problémy při denaturaci vzorku DNA. Špatná denaturace může být v důsledku přítomnosti > 40 mM soli ve vzorku DNA. Neúplná denaturace DNA může vést k falešným výsledkům!

POZNÁMKA: Při použití ABI POP7 polymeru nespecifický fragment 80-90 nt je obvykle přítomný a může se shodovat s kontrolními fragmenty!

Nízké D-fragmenty: neúplná denaturace DNA!

Vyplňte alternativní text Obrázek 4: Vliv neúplné denaturace na D- fragmenty. D-fragmenty jsou nízké, pokud je denaturace DNA neúplná (zde vyvolaná přidáním soli). MLPA výsledky u DNA vzorků obsahující A. TE; B. TE + 40 mM NaCl; C. TE + 100 mM NaCl.

8.2. KONTROLA BEZ DNA

U typické kontroly bez DNA jsou viditelné pouze čtyři Q-fragmenty. Nicméně, MLPA PCR reakce je více náchylná k nespecifickým píkům u kontroly bez DNA než běžná PCR. U některých směsí sond může být několik píků u kontroly bez DNA. Tyto nespecifické píky by neměly ovlivňovat výsledky MLPA: když se používá dostatečné množství vzorku DNA, tyto píky by měly být potlačeny MLPA sondami, podobně jako Q - fragmenty na Obrázku 3. Informujte MRC-Holland v případě, že nespecifické píky v kontrole bez DNA jsou opakovatelně vyšší než u Q-fragmentů.

8.3. PROBLÉMY S ODPAŘOVÁNÍM

Odpařování se může objevit (A) při pipetování ligační reakce při 54 °C, nebo (B) při hybridizaci přes noc. V případě podezření na problémy s odpařováním, vám mohou pomoci následující opatření:

(A): Snižte čas manipulace použitím vícekanálové pipety.
(B): Otestujte odpařovaní inkubací 8 ul H2O přes noc při 60 °C; > 5 ul H2O by mělo zůstat. Chcete-li snížit odpařování: 1. Ověřte, že vyhřívané víko funguje dobře; 2. Optimalizujte zvýšení / snížení tlaku víka na zkumavky; 3. Vyzkoušet různé zkumavky (například Thermo Fischer ABgene AB-0773, AB-0451); 4. Použijte minerální olej (Vapor-lock, Qiagen 981611): přidejte kapku oleje na DNA vzorek, jen tolik, aby byl pokrýt. Odstraňovat olej není potřeba. Po přidání pufru a MLPA sond nebo polymerázového mixu: centrifugujte velmi krátce. Po přidání ligázové směsi: míchejte jemně pipetováním nahoru a dolů.

8.4. DIAGRAM POSTUPU PŘI KONTROLE KVALITY

9. ANALÝZA DAT

9.1. COFFALYSER.NET PRO ANALÝZU MLPA DAT

Software Coffalyser.Net by měl být použit pro analýzu MLPA dat. Manuál Coffalyser.Net poskytuje krok za krokem instrukce, jak provádět analýzu MLPA dat. Software i manuál jsou volně ke stažení na mlpa.com. Tato část popisuje základní principy MLPA analýzy. Coffalyser.Net analýza je založena na těchto zásadách, ale používá robustnější algoritmus. Kromě toho, Coffalyser.Net vybere nejvhodnější metody analýzy pro každý MLPA kit a nabízí rozsáhlou kontrolu kvality6. Pro IVD registrované aplikace MLPA musí být použit Coffalyser.net! Použití jiného softwaru může vést k nesprávným výsledkům!

9.2. ZÁSADY NORMALIZACE MLPA DAT I: Od píků ke kvocientu dávky (DQ)

Absolutní fluorescenci měřenou pomocí kapilární elektroforézy nelze použít přímo pro výpočet počtu kopií, neboť je ovlivněna mnoha proměnnými. Za prvé, fluorescence každé sondy musí být normalizována v každém vzorku, abyste získali smysluplné výsledky. Za druhé, je třeba provést porovnání různých vzorků, abyste zjistili, který vzorek má abnormální počet kopií. Z tohoto důvodu se MLPA normalizace skládá z 2 kroků: intra-vzorková normalizace (porovnání píků sond v rámci vzorku) a mezi-vzorková normalizace (porovnání relativních píků sond MEZI vzorky.)

1. Normalizace v rámci vzorku. V každém vzorku se porovnávají píky jednotlivých sond S píky referenčních sond. Referenční sondy detekují sekvence, u kterých se očekává, že mají normální počet kopií ve všech vzorcích. Téměř všechny kity MLPA obsahují 8 nebo více referenčních sond umístěných na různých chromozómech.

Relativní signály sond detekované v kroku 1 se pak používají v:

2. Normalizace mezi vzorky. Finální poměry sond jsou určeny porovnáním relativních píků sond v testovaném vzorku DNA S píky sond všech referenčních vzorků. Předpokládá se, že referenční vzorky budou mít normální počet kopií pro referenční i cílové sondy.
Profil píků testovaného vzorku DNA bez genomových abnormalit bude totožný s profilem referenčních vzorků: finální poměry sond stanovené v kroku 2 budou ~ 1,0. U heterozygotní delece budou poměry sond ~ 0,5. Tyto finální poměry sond se také nazývají Kvocient dávky (Dosage Quotient - DQ). Coffalyser.Net vypočítá DQ pro každou sondu v každém vzorku. Sondy jsou uspořádány podle chromozomální lokalizace pro správnou interpretaci; a to také pomáhá při odhalování drobných změn, jako je mozaika.

9.3. ZÁSADY NORMALIZACE MLPA DAT II: Od kvocientu dávky k počtu kopií

Jak rozlišit normální výsledky, delece a duplikace? Tabulka 1 uvádí vztahy mezi počtem kopií a typickou distribucí DQ.

Vyplňte alternativní text Tabulka 1 – Vztah mezi kvocientem dávky a počtem kopií (na základě normálního stavu - 2 kopie)

Kromě toho, standardní odchylka každé sondy by měla být měřena pro zajištění věrohodnosti výsledků7. Coffalyser.Net software považuje výsledek za statisticky významnou změnu, pokud:

DQ sonda 1 vzorek A > 2 směrodatné odchylky vyšší/nižší než průměr DQ sondy 1, ref. vzorku X, Y, Z 

  1. Heterozygotní delece, duplikace, může být přítomna, pokud platí následující:
  2. DQ sonda 1, vzorek A pod 0,7 nebo nad 1,3 - indikuje heterozygotní deleci nebo duplikaci8.

7 Coffalyser.Net začíná analýzu ze surových dat (korekce baseline, identifikace píků) a poskytuje rozsáhlou kontrolu kvality (například použité množství DNA; kompletní DNA denaturace, stupeň šikmosti). Korekce sklonu píků je jednou z mnoha možností.
8 Standardní odchylka se liší u každé sondy a závisí na mnoha faktorech, včetně 1. kvality vzorků DNA (čistota; fragmentace DNA, depurinace, další úpravy); 2. množství použitého vzorku DNA; 3. počet a kvalita referenčních a pozitivních vzorků; 4. experimentální podmínky (například přesnost pipetování, rovnoměrnost teploty v termocykleru, kvalita separace a detekce amplikonů); 5. metoda použitá pro analýzu dat.

U mozaikových a nádorových vzorků nejsou mezní hodnoty 0,7 / 1,3 v Coffalyser.Net použitelné, protože DQ mohou nabývat jakékoliv hodnoty: jejich vypočtené hodnoty DQ budou záviset na a) rozsahu změn počtu kopií A b) procentech různých buněčných typů ve vzorku DNA9. Coffalyser.Net určuje význam změny signálu sondy vyhodnocením velikosti vypočítaného DQ v kombinaci s jeho statistickou významností v experimentu, například částečná změna počtu kopií může být ještě rozpoznána, pokud a) byl experiment dobře proveden, b) podobný DQ byl získán pro sousední sondy a c) bylo zde dostatečné procento postižených buněk.

9 Coffalyser.Net používá hodnoty 0,7 a 1,3 jako cut-off hodnoty pro heterozygotní delece nebo duplikace (při normálním diploidním stavu). Coffalyser.Net tak používá ostré cut-off hodnoty, zatímco Tabulka 1 udává podstatně nejednoznačný rozsah DQ (0.65<DQ<0.80; 1.20<DQ<1.30) Coffalyser.Net však také vypočítá, zda je DQ sondy statisticky odlišné od toho v referenční populaci. Coffalyser.Net může být také použit na nádorových vzorcích a může identifikovat některé mozaikové případy.9 Příklad: Pokud 30% buněk ve vzorku obsahuje 3 kopie chromozomu 21 a 70% buněk obsahuje 2 kopie, vypočtené DQ pro chr. 21 sondy bude: (30% x 3) + (70% x 2) / 2 * = 1,15 (2 *: počet kopií přítomných v referenčních vzorcích).

10. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Informace uvedené v popisu produktu pro specifický MLPA kit jsou zásadní pro správnou interpretaci výsledků MLPA.

Posouzení, zda získané výsledky jsou spolehlivé a interpretace výsledků MLPA správná, vyžaduje dobrou znalost MLPA metody a testované aplikace. Mějte na paměti následující:

  • U většiny aplikací jsou hlavní příčinou genetických defektů malé (bodové) mutace, z nichž většina nebude detekována MLPA.
  • MLPA kity nedetekují delece/duplikace ležící mimo cílové sekvence svých sond. MLPA nebude detekovat většinu inverzí, translokací, ani změny v počtu kopií, které leží mimo cílovou sekvenci rozpoznávanou MLPA sondou. I když MLPA nezjistila žádnou odchylku, je zde stále možnost, že biologické změny v tomto genu nebo v chromozomální oblasti existují, ale zůstávají nezjištěny.
  • Změny (SNP, bodové mutace, malé indels) v cílové sekvenci DNA sondy mohou způsobovat falešné výsledky. Mutace/SNPs (i když > 20 nt od místa ligace sond) mohou snížit signál sondy buď blokací ligace sond nebo destabilizací vazby mezi sondou a cílovou DNA10.
  • Změny v počtu kopií detekované jedinou sondou vždy vyžadují potvrzení. Sekvenování cílové sekvence sondy může ukázat, zda snížený signál sondy je způsoben mutací/polymorfismem. Nález dvou heterozygotních sekvencí obvykle znamená, že vzorek DNA obsahuje dvě různé alely. Naproti tomu, detekce pouze jediné vzácné alely sekvenováním ještě neznamená, že druhá "normální" alela je deletována: nižší signál sondy může být způsoben homozygotním SNP, dokonce i když je SNP velmi vzácný!
  • Long-range PCR a qPCR jsou často používány pro potvrzení delece (jednoho) exonu. Můžete si také navrhnout Vaše vlastní syntetické MLPA sondy pro potvrzení výsledků (např Hills A. et al., (2010), Mol Cytogenet. 03:19). Informace o designu MLPA sond jsou dostupné na mlpa.com (pouze pro výzkumné účely RUO).
  • Kontaminace DNA vzorků cDNA nebo PCR amplikony jednotlivých exonů může vést ke zvýšenému signálu sondy11. Analýza nezávisle odebraného vzorku sekundární DNA může vyloučit tento druh kontaminačního artefaktu.
  • Ne všechny delece a duplikace zjištěné MLPA jsou patogenní. MRC-Holland nemůže poskytnout informace, zda delece nebo duplikace specifického exonu bude mít za následek onemocnění. U mnoho genů jsou popsány exony, které jsou přítomny pouze v některých transkripčních variantách. U některých genů, jako je DMD, delece ve čtecím rámci vedou k mírnému nebo žádnému onemocnění12. Duplikace jednoho nebo více exonů může však porušit kopii tohoto genu, což vede k onemocnění, zatímco kompletní genová duplikace nemusí být patogenní. Všimněte si, že duplikace zahrnující první nebo poslední exon genu může ponechat jednu funkční intaktní kopii a nemusí být patogenní.
  • Zárodečné změny v počtu kopií u zdravých jedinců lze nalézt na http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home. Určité odchylky v počtu kopií mohou být způsobeny somatickými změnami. Například, somatická trizomie 12 je časnou známkou chronické lymfocytární leukémie (CLL).
  • Špatná denaturace vzorku DNA může vést ke zdánlivé deleci několika sond vedle sebe a jde tak o falešně pozitivní výsledek! Přítomnost solí ve vzorcích DNA (například> 40 mM NaCl) zabraňuje DNA denaturaci GC-bohatých oblastí. Sekvence v blízkosti těchto CpG ostrovů může denaturovat při 98 oC, ale bude se okamžitě spojovat po ochlazení, neboť nedenaturovaný CpG ostrov drží tyto dva řetězce dohromady. Vazba sondy na cílovou sekvenci v těchto regionech bude narušena, což vede ke snížení signálu u sond umístěných v oblasti několika kb od těchto silných CpG ostrovů. Proto D-fragmenty vždy zkoumejte pozorně!
  • MLPA testy poskytují průměrný počet kopií cílové sekvence v buňkách, ze kterých se vzorek DNA izoloval. V případě, že některé sondy pro přilehlé sekvence mají neobvyklou hodnotu, ale nedosahují obvyklé prahové hodnoty pro deleci/duplikaci, může být přítomna mozaika.
  • V případě zjevné homozygotní delece by měl být elektroforeogram vizuálně zkontrolován, aby se zjistilo, zda je signál pod hranicí detekce.
  • Změny v počtu kopií detekované referenčními sondami pravděpodobně nesouvisí s testovaným onemocněním nebo stavem. Totožnost referenčních sond je k dispozici na vyžádání.
  • V některých případech pro správnou interpretaci výsledků může být nezbytná analýza rodičovských vzorků.

10 Při navrhování sond známé SNP jsou eliminovány, pokud je to možné. Nicméně, nové SNP jsou neustále objevovány. Prosím, dejte nám vědět, pokud polymorfismus nebo časté patogenní mutace ovlivňují signál sondy.
11 Varga RE et al. (2012). MLPA-based evidence for sequence gain: pitfalls in confirmation and necessity for exclusion of false positives. Anal Biochem. 421:799-801
12 Schwartz M. a Duno M. (2004). Improved molecular diagnosis of dystrophin gene mutations using the multiplex ligationdependent probe amplification method. Genet Test. 8:361-7.

Výsledky MLPA jsou spolehlivější, pokud:

  • Referenční vzorky: standardní odchylka všech sond je nízká (<10%) a DQ mezi 0,8-1,2.
  • Testované vzorky: standardní odchylka referenčních sond je nízká (<10%) a DQ mezi 0,8-1,2.
  • Sondy vykazují snížený nebo zvýšený signál u sousedních exonů (delece několika exonů nebo duplikace).
  • Stejný výsledek se získá v nové MLPA, při které se použije méně DNA (pokud je to možné) nebo pomocí různých referenčních vzorků. Použije-li se méně DNA, veškeré případné nečistoty, které mohou mít vliv na signál sond, se naředí.

Výsledky MLPA budou pravděpodobně nespolehlivé pokud:

  • Sondy pro nesousední exony vykazují snížený nebo zvýšený signál, například delece exonu 3 a 17.
  • Ve stejném vzorku jedna nebo více referenčních sond vykazuje abnormální počet kopií.
  • Změny v počtu kopií jsou detekovány s neobvykle vysokou frekvencí v souboru pacientů s určitým onemocněním.

11. STRUČNÝ PROTOKOL MLPA

1. DNA denaturace

  • Zahřejte 5 ul vzorku DNA po dobu 5 minut při 98 °C

2. Hybridizace sondy ke vzorku DNA

  • Zchlaďte na pokojovou teplotu, otevřete zkumavku
  • Přidejte směs 3ul hybridizačního master mixu*
  • Inkubujte 1 minutu při 95 °C a hybridizujte 16 hodin při 60 °C

3. Ligace hybridizovaných sond

  • Snižte teplotu termocykleru na 54 °C, otevřete zkumavku
  • Přidejte 32 ul Ligáza- 65 master mixu*, inkubujte 15 minut při 54 °C
  • Zvyšte teplotu pro inaktivaci enzymu ligázy: 5 minut 98 °C

4. PCR amplifikace ligovaných sond

  • Zchlaďte na pokojovou teplotu, otevřete zkumavku
  • Přidejte 10 ul polymerázového master mixu* při pokojové teplotě
  • Spusťte PCR

5. Kapilární elektroforéza PCR produktů

6. Analýza výsledků

  • Určete relativní velikost píků v každém vzorku
  • Porovnejte tyto výsledky s referenčními vzorky

*Hybridizace: 1.5 µl SALSA směs sond +1.5 µl MLPA buffer
Ligáza - 65: 3 ul Ligase Buffer A + 3 ul Ligase Buffer B + 25 ul vody + 1 ul Ligase-65.
Polymeráza: 7,5 ul vody + 2 ul PCR primerů + 0,5 ul SALSA Polymerase

ZABRAŇTE FALEŠNÝM POZITIVNÍM NEBO NEGATIVNÍM VÝSLEDKŮM:

Přečtěte si úplný protokol a důsledně dodržujte tento protokol a 

PŘEČTĚTE SI NEJNOVĚJŠÍ POPIS PRODUKTU SPECIFICKÝ PRO PŘÍSLUŠNÝ KIT

7 nejkritičtějších bodů pro získání dobrých výsledků MLPA

  1. V každém MLPA experimentu zahrňte alespoň 3 různé referenční vzorky.
  2. Použijte referenční vzorky, které byly izolovány stejnou metodou jako testované vzorky.
  3. Pro analýzu dat použijte Coffalyser.Net.
  4. Zkontrolujte kontrolní D-fragmenty o délce 88 a 96 nt pro úplnou denaturaci DNA vzorků.
  5. Roztoky pro eluci a ředění DNA by měly obsahovat 5-10 mM Tris-HCl pH 8-8,5. Vzorky DNA ve vodě budou poškozeny depurinací během 5 minutového kroku denaturace DNA.
  6. Přesné pipetování 3 μl hybridizačního master mixu je naprosto nezbytné pro dosažení spolehlivých výsledků.
  7. Pro elektroforézu nepoužívejte staré kapiláry ani gel.

Historie dokumentu – MLPA obecný protokol

Kontaktujte nás

BIOGEN PRAHA s.r.o.
Ke sv. Izidoru 2293/4A
140 00 PRAHA 4

Tel.: +420 241 401 693
Fax: +420 241 401 694
E-mail: biogen@biogen.cz

Novinky na e-mail

Vaše osobní údaje nejsou nikde zveřejňovány a splňují požadavky GDPR.