Úvod Magazín Představujeme nový kit SALSA® MLPA® probemix P041-B1 ATM-1 a P042-B2 ATM-2

Představujeme nový kit SALSA® MLPA® probemix P041-B1 ATM-1 a P042-B2 ATM-2

Přinášíme vám veškeré informace o nových verzích kitu SALSA® MLPA® probemix. P041 verze B1 byla uvedena na trh již v listopadu 2014. P042 verze B2 má v porovnání s kitem B1 malou změnu v délce jedné sondy, ale bez změny v detekovaných sekvencích.

Účel použití kitů Charakteristika výkonu testu
Jak kity používat Analýza dat
Klinické pozadí Interpretace výsledků
Obsah P041-B1 a P042-B2 kitů Limitace metody
Validace MLPA metody Související SALSA MLPA kity

Katalogová čísla

  • P041-025R: SALSA® MLPA® probemix P041 ATM-1, 25 reakcí.
  • P041-050R: SALSA® MLPA® probemix P041 ATM-1, 50 reakcí.
  • P041-100R: SALSA® MLPA® probemix P041 ATM-1, 100 reakcí.
  • P042-025R: SALSA® MLPA® probemix P042 ATM-2, 25 reakcí.
  • P042-050R: SALSA® MLPA® probemix P042 ATM-2, 50 reakcí.
  • P042-100R: SALSA® MLPA® probemix P042 ATM-2, 100 reakcí.

Účel použití kitů

Obě verze jsou určené k použití v kombinaci s reagenčním SALSA® MLPA® kitem a dostupné pro různý počet reakcí. MLPA reagenční kity jsou k dispozici s FAM neboCy5.0 značenými primery, vhodné pro kapilární sekvenátory AppliedBiosystemsa Beckman.

Salsa MLPA kity P041 ATM-1 a P042 ATM-2 jsou testy pro in vitro diagnostiku (IVD)1 nebo pouze pro výzkumné účely (RUO). Slouží pro detekci delecí nebo duplikací v lidském genu ATM. Cílem je potvrzení možné příčiny a klinické diagnózy ataxia-teleangiektázie nebo dědičné predispozice vzniku rakoviny (nejen jako rakovina prsu). Kity můžete použít také pro molekulární genetické testování u rodinných příslušníků s rizikem onemocnění.

Jak kity používat

Test používejte s lidskou DNA izolovanou z periferní krve. Není určen k použití s DNA izolovanou z materiálů fixovaných formalinem a zalitých do parafinu nebo z čerstvých nádorů. Delece nebo duplikace detekovaných kitů P041/P042 ověřte jinou metodou. Zejména delece nebo duplikace detekované pouze jedinou sondou vždy vyžadují ověření jiným způsobem. Většina defektů v ATM jsou bodové mutace, které nebudou detekovány metodou MLPA. Doporučujeme proto používat tyto Salsa MLPA kity v kombinaci se sekvenační analýzou genu ATM.

Tento test není určený k použití jako samostatný test pro klinické rozhodování. Výsledky musí být interpretovány molekulárním genetikem nebo ekvivalentním odborníkem.

Klinické pozadí

Mutace v genu ATM jsou příčinou ataxie-teleangiektázie (A-T, také známá jako Louis-Bar syndrom). A-T je autosomálně recesivní onemocnění postihující nervový systém, imunitní systém a několik dalších orgánů. Onemocnění je charakterizováno progresivní cerebelární ataxií, teleangiektázií a predispozicí k malignitám, zvláště leukémiím a lymfomu.

Pacienti s A-T mají často oslabený imunitní systém a vyvíjejí se u nich chronické plicní infekce. A-T se vyskytuje u 1 z 40 000 až 100 000 lidí po celém světě. Protein ATM je členem rodiny fosfatidylinositol-3 proteinkináz, které reagují na poškození DNA, a to fosforylací klíčových substrátů zapojených do oprav DNA nebo do kontroly buněčného cyklu. To by mohlo vysvětlovat zvýšené riziko vzniku malignit u ATM heterozygotů, zejména rakoviny prsu.

Přibližně 1 % pacientů s rakovinou prsu nese mutace v ATM (Buys et al., 2017, Lerner-Ellis et al., 2015). Relativní riziko vzniku rakoviny prsu se odhaduje na 2-4 krát vyšší ve srovnání s běžnou populací (Tavtigian et al., 2009, Thompson a kol., 2005). Zárodečné heterozygotní patogenní ATM varianty byly zjištěny také u několika typů leukémií, lymfomu a dědičné rakoviny slinivky břišní (Bullrich et al., 1999, Oguchi et al., 2003, Roberts et al., 2012).

Struktura genu
Transkripční varianty
Číslování exonů
Gen ATM pokrývá ~146 kb na chromozómu 11q22.3. ATM LRG_135 je dostupná na www.lrg-sequence.org a je stejná na Genbank NG_009830.1. Pro ATM byla popsána jedna transkripční varianta kódující protein v plné délce (NM_000051.3; 13147 nt; kódující sekvence 386-9556; www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/472). Tato sekvence je referenční standard v NCBI RefSeq projektu. ATG start místo je lokalizováno v exonu 2 (386-388) a stop kodon je umístěný v exonu 63 (9554-9556). Číslování exonů použité v tomto popisu P041-B1 P042-B2 kitů a v analýze listu Coffalyser.Net je identické s číslováním exonů v LRG_135 sekvenci a v NCBI NG_009830.1 referenční sekvenci (exony 1-63). Číslování exonů používané zde se může lišit od literatury. Prosím, oznamte nám jakékoliv chyby.

Obsah P041-B1 a P042-B2 kitů

Identita genů detekovaných referenčními sondami je k dispozici on-line na www.mlpa.com.

Kity P041-B1 a P042-B2 obsahují každý 34 sond pro gen ATM. Pokud se používají společně, sonda pro každý exon ATM je přítomna, včetně jedné sondy pro intron 1, dvou sond pro exon 1 a 61 a dvou sond pro intron 61.

P041-B1 kit obsahuje 45 MLPA sond s amplifikačních produkty mezi 130 a 485 nt včetně 11 referenčních sond. P042-B2 kit obsahuje 45 sond s amplifikačních produkty mezi 131 a 485 nt, včetně 11 referenčních sond.

Každý kit obsahuje devět kontrolních fragmentů, které generují amplifikační produkty mezi 64 a 105 nt:

  • čtyři DNA kvantitativní fragmenty (Q-fragmenty),
  • tři DNA denaturační fragmenty (D-fragmenty),
  • jeden chromozóm X
  • jeden chromozóm Y-specifický fragment

Q-fragmenty jsou viditelné pouze, pokud je použito méně než 100 ng DNA vzorku. Nízký signál 88 nebo 96 nt fragmentu naznačuje neúplnou DNA denaturaci. Více informací o tom, jak interpretovat výsledky z těchto kontrolních fragmentů, můžete nalézt v MLPA obecném protokolu.

Validace MLPA metody

Interní validace MLPA metody na 16 vzorcích DNA ze zdravých jedinců je nezbytná, a to zejména při prvním použití MLPA, nebo při změně zpracování vzorků, metodě extrakce DNA nebo používaného přístroje. Tato validace by měla vykazovat standardní odchylku <0,10 pro všechny sondy v experimentu.

Požadavky na vzorky

Izolovaná DNA z periferní krve bez nečistot, které ovlivňují MLPA reakci. Více informací naleznete v části o zpracování DNA vzorku v MLPA obecném protokolu.

Referenční vzorky

Referenční vzorky DNA by měly být odvozeny ze stejného typu tkáně, zpracovány za použití stejného postupu a připraveny za použití stejného způsobu, jako je například extrakce DNA ze vzorku pacienta. Referenční vzorky by měly být odvozeny od nepříbuzných jedinců, kteří jsou z rodin bez historie A-T nebo A-T spojených nádorů. Další informace týkající se výběru a použití referenčních vzorků najdete v MLPA obecném protokolu.

MRC-Holland nemůže poskytnout pozitivní vzorky DNA. Zahrnutí pozitivních vzorků se doporučuje v každém experimentu.

Charakteristika výkonu testu

Frekvence delecí ATM nebo duplikací u A-T je cca 2-5 %, zatímco u rakoviny prsu je nižší než 0,1 %. Analytická citlivost a specificita pro detekci delecí nebo duplikací v genu ATM je velmi vysoká a může být považována za >99 % (na základě hodnocení literatury 2008-2016).

Analytická výkonnost může být ohrožena: SNP nebo dalšími polymorfismy (např. indels) v cílové sekvenci DNA, nečistotami ve vzorku DNA, neúplnou DNA denaturací, použitím nedostatečného nebo příliš velkého množství vzorku DNA, použitím nedostatečných nebo nevhodných referenčních vzorků, problémy s kapilární elektroforézou nebo špatným postupem normalizace dat a dalšími technickými chybami. MLPA obecný protokol obsahuje technické pokyny a informace o hodnocení/normalizaci dat.

Analýza dat

Coffalyser.Net software musí být použit pro analýzu dat v kombinaci s listem pro specifickou šarži - MLPA Coffalyser list. Nejnovější verze by měla být použita a je volně ke stažení na www.mlpa.com. Použití jiného ne-proprietárního softwaru může vést k neprůkazným nebo falešným výsledkům. Pro více informací o MLPA kontrole kvality a analýze dat, viz Coffalyser.Net Manual.

Interpretace výsledků

Očekávané výsledky pro ATM specifické MLPA sondy jsou počty kopií alel 2 (normální), 1 (heterozygotní delece), 0 (homozygotní delece), 3 (heterozygotní duplikace) nebo 4 (homozygotní duplikace).

Standardní odchylka všech sond v referenčních vzorcích by měla být <0,10 a kvocient dávky (DQ) referenčních sond ve vzorcích pacientů by měl být mezi 0,80 a 1,20. Pokud jsou tato kritéria splněna, následující mezní hodnoty pro DQ sond mohou být použity k interpretaci výsledků MLPA:

Interpretace výsledků MLPA

Falešně pozitivní výsledky:

Vezměte prosím na vědomí, že abnormality zjištěné jedinou sondou (nebo více po sobě jdoucích sond) mají stále značnou šanci mít falešně pozitivní výsledek. Neúplná DNA denaturace (například z důvodu kontaminace solí) může vést ke snížení signálu sondy, zejména u sond umístěných v CpG ostrově nebo v blízkosti genu LDLR. Použití dalšího kroku čištění nebo alternativní metody extrakce DNA může takové případy vyřešit.

Falešné pozitivní výsledky - duplikace:

Kontaminace DNA vzorků cDNA nebo PCR amplikony z jednotlivých exonů mohou vést k falešně pozitivním duplikacím (Varga et al., 2012). Analýza nezávisle odebraného vzorku sekundární DNA může vyloučit tento typ artefaktů.


Varianty normálního počtu kopií u zdravých jedinců jsou popsány v databázi genomových variant. Uživatelé by měli vždy konzultovat nejnovější aktualizaci databáze a vědecké poznatky při interpretaci jejich výsledků.

Ne všechny odchylky zjištěné MLPA jsou patogenní. V některých genech, intragenové delece jsou známy a vedou k velmi mírné nebo žádné chorobě (Schwartz et al., 2007). Pro mnoho genů, existuje více než jedna transkripční varianta. Změny v počtu kopií exonů, které nejsou přítomny ve všech transkripčních variantách, nemusí mít klinický význam. Duplikace, které zahrnují první nebo poslední exon genu (například exony 1-3), mohou v některých případech mít za následek inaktivaci této kopie genu. Změny v počtu kopií detekované referenčními sondami nebudou mít pravděpodobně žádný vztah k testovanému onemocnění.

Zejména delece posledních exonů (exony 62-63) se často vyskytují (vlastní validační pozorování, Micol a kol. 2011, Nakamura a kol. 2012, Podralska a kol. 2014, Susswein a kol. 2016, Tunga kol. 2015). Duplikace těchto exonů zřejmě není spojena se zvýšeným rizikem dědičné rakovinu prsu (LaBreche et al., 2017).


Limitace metody

  • Ve většině populací jsou hlavní příčinou genetických defektů v ATM genu malé (bodové) mutace, z nichž žádná nebude detekována pomocí MLPA kitů P041/042 ATM.
  • MLPA nemůže zjistit žádné změny, které leží mimo cílovou sekvenci sond, a nezjistí počet kopií neutrální inverze nebo translokace. I když MLPA nedetekuje žádné aberace, zůstává možnost, že existují biologické změny v tomto genu nebo chromozomální oblasti, ale zůstávají nedetekované.
  • Změny sekvence (např. SNP, bodové mutace, malé indels) v cílové sekvenci sondy mohou způsobit falešně pozitivní výsledky. Mutace / SNP (i když >20 nt od ligačního místa sondy) může snižovat signál sondy tím, že brání ligaci oligonukleotidové sondy nebo destabilizuje vazbu sondy na DNA.

Potvrzení výsledků

Změny v počtu kopií detekované pouze jedinou sondou vždy vyžadují ověření jinou metodou. Zřejmá delece detekovaná jedinou sondou může být způsobena např. mutací / polymorfismem, který zabraňuje ligaci nebo destabilizuje vazbu sondy na DNA. Sekvenační analýza může stanovit, zda mutace nebo polymorfismy jsou přítomny v cílové sekvenci sondy. Nalezení heterozygotní mutace nebo polymorfismu poukazuje na to, že dvě odlišné alely jsou přítomné ve vzorku DNA a lze získat falešně pozitivní výsledek MPLA.

Změny v počtu kopií detekované jednou nebo více než jednou po sobě jdoucích sond by měly být potvrzeny jinou nezávislou metodou, jako je long-range PCR, qPCR, array CGH nebo Southern blotting, kdykoli je to možné. Delece / duplikace delší než 50 kb mohou být často potvrzeny FISH.

Databáze ATM mutací

Důrazně doporučujeme uživatelům ukládat pozitivní výsledky do ATM databáze mutací. Doporučení pro názvosloví, jak popisovat delece / duplikace jednoho nebo více exonů naleznete tady. Prosím, oznamte změny v počtu kopií detekované referenčními sondami, falešně pozitivní výsledky kvůli SNP a neobvyklé výsledky (například duplikace ATM exonů 6 a 8, ale ne exonu 7) do MRC-Holland: info@mlpa.com.

Tabulka 1

  • (a) Číslování exonů použité v tomto popisu kitů P041-B1 a P042-B2 a v analýze listu Coffalyser.Net je stejné jako u sekvence LRG_135 a v NCBI NG_009830.1 referenční sekvenci (exony 1-63).
  • # SNP rs587780628 může ovlivnit signál sondy. V případě jasné delece se doporučuje sekvenovat cílovou oblast této sondy.
  • ± SNP rs201159454 může ovlivnit signál sondy. Frekvence 4-16% byla hlášena, avšak my jsme se nikdy nesetkali s odchylkou u této sondy v důsledku tohoto SNP.V případě jasné delece se doporučuje sekvenovat cílovou oblast této sondy.

Tabulka 1b

  • (a) Číslování exonů použité v tomto popisu kitů P041-B1 a P042-B2 a v analýze listu Coffalyser.Net je stejné jako u sekvence LRG_135 a v NCBI NG_009830.1 referenční sekvenci (exony 1-63).
  • ¥ Změněno ve verzi B2 (od šarže B2-0217 dále). Malá změna délky, žádná změna v detekované sekvenci.
  • Ж Tato sonda se skládá ze tří částí a má dvě ligační místa. Nízký signál této sondy může být v důsledku depurinace, například, když pufrační kapacita je nedostatečná nebo je delší čas denaturace.

Tabulka 2

  • (a) Číslování exonů použité v tomto popisu kitů P041-B1 a P042-B2 a v analýze listu Coffalyser.Net je stejné jako u sekvence LRG_135 a v NCBI NG_009830.1 referenční sekvenci (exony 1-63).
  • (b) Ligační místa P041-B1 a P042-B2  ATM sond jsou označeny podle Refseq sekvence NM_000051.3 obsahující 63 exonů.
  • (c) Pouze část sekvence sond je uvedena. Kompletní sekvence sond jsou k dispozici na www.mlpa.com. Prosím, dejte nám vědět, pokud najdete nějaké chyby: info@mlpa.com.
  • Ж Tato sonda se skládá ze tří částí a má dvě ligační místa. Nízký signál této sondy může být v důsledku depurinace, například, když pufrační kapacita je nedostatečná nebo je delší čas denaturace.
  • ± SNP rs201159454 může ovlivnit signál sondy. Frekvence 4-16% byla hlášena, avšak my jsme se nikdy nesetkali s odchylkou u této sondy v důsledku tohoto SNP.V případě jasné delece se doporučuje sekvenovat cílovou oblast této sondy.
  • # SNP rs587780628 může ovlivnit signál sondy. V případě jasné delece se doporučuje sekvenovat cílovou oblast této sondy.

Související SALSA MLPA kity

  • P002 / P087 BRCA1  - dědičná rakovina prsu, screening BRCA1.
  • P037 / P038 / P040 CLL - nádorové směsi, které obsahují sondy pro geny zapojené do chronických lymfocytárních leukémií. Několik ATM sond je zahrnut
  • P045 / P090 / P077 BRCA2 - dědičná rakovina prsu, screening BRCA2.
  • P190 CHEK2- obsahuje sondy pro CHEK2, ATM a TP53 zapojené do predispozice k rakovině.
  • P316 Recesivní ataxie - obsahuje sondy pro APTX, SETX, FXN zapojené do recesivní ataxie.
  • P377 Směs hematologických maligních nádorů, která obsahuje sondy pro geny zapojené do hematologických malignit. Několik ATM sond je zahrnuto.

Historie produktů P041/042

Historie produktů

Máte dotazy ohledně SALSA® MLPA® probemix P041-B1 ATM-1 a P042-B2 ATM-2? Napište nám

Položky označené hvězdičkou (*) jsou povinné.

Kontaktujte nás

BIOGEN PRAHA s.r.o.
Ke sv. Izidoru 2293/4A
140 00 PRAHA 4

Tel.: +420 241 401 693
Fax: +420 241 401 694
E-mail: biogen@biogen.cz

Novinky na e-mail