Úvod E-learningové kurzy Průvodce řešením problémů s profily píků MLPA

Průvodce řešením problémů s profily píků MLPA

Přinášíme vám průvodce pro řešení nejčastějších problémů s profily píků MLPA. Popíšeme vám jednotlivé potíže a nabídneme vám, jak je nejlépe odstraníte. Použijte hrubá data a kontrolu kvality fragmentů ze svých elektroforegramů a analyzujte kvalitu svých profilů píků.

Potřebujete pomoci s e-learningovým kurzem pro problémy s profily píků MLPA? Napište nám!

Vyberte svůj profil píků

Průvodce řešením problémů s profily píků MLPA

1. MLPA profil píků není vidět

MLPA profil píků není vidět

Profil MLPA píků není vidět v surovém elektroforegramu. Je vidět pouze velikostní standard.

Příčina

MLPA PCR produkty nebyly přidány do injekční směsi.

Řešení

Připravte novou injekční směs, která obsahuje MLPA produkty a velikostní standard.

2. Velikostní standard není vidět

Velikostní standard není vidět

Píky velikostního standardu nejsou v elektroforegramu hrubých dat viditelné.

Příčina

Velikostní standard nebyl přidán do injekční směsi.

Řešení

Připravte novou injekční směs, která obsahuje velikostní standard a MLPA produkty a opakujte analýzu vzorků.

3. Píky velikostního standardu nemají podobnou výšku

Píky velikostního standardu nemají podobnou výškuNa obrázku se výšky každého píku GS500 velikostního standardu velmi liší. V normálním GS500 profilu by měla být výška každého píku velikostního standardu podobná.

Příčiny

Použije-li se GS500 (ABI) velikostní standard, očekává se, že výška píků velikostního standardu bude podobná (viz obrázek dole). Pokud to tak není, krok denaturace před separací fragmentů byl pravděpodobně vynechán.

Řešení

Použijte HiDi formamid pro přípravu injekční směsi. Před separací fragmentů inkubujte injekční směs po dobu 3 minut při teplotě 86 °C a pak okamžitě při teplotě 4 °C po dobu 2 minut.
Výška píků velikostního standardu by měla být podobnáNormální profil velikostního standardu GS500 - všechny píky standardu mají stejnou intenzitu signálu.

4. Píky se nevrací/neklesají na bazální hladinu

Píky se nevrací/neklesají na bazální hladinuSignál mezi MLPA píky se nevrací (neklesá) na základní hladinu.

Příčina (i)

Hodně PCR produktu v injekční směsi.

Řešení (i)

Použijte méně produktu v injekční směsi. Množství PCR by nemělo být více než 10% celkového objemu. Zřeďte PCR produkty s ultra-čistou vodou.

Příčina (ii)

Nastavení injekčního napětí nebo času je příliš vysoké

Řešení (ii)

Snižte injekční napětí nebo čas.

5. Klesání píků pouze v MLPA profilu

Klesání píků pouze v MLPA profilu Intenzita signálů MLPA fragmentů se snižuje se zvyšující se délkou. Naopak všechny fragmenty velikostního standardu (oranžové) mají podobnou výšku.

Příčina

Větší odpařování během hybridizace. Ověřte odpařování, a to přidáním 8 μl vody do zkumavky, a tu hybridizujte přes noc. Další den by nejméně 5 μ l vody mělo zůstat ve zkumavce.

Řešení

  • Důkladně zkontrolujte, zda jsou zkumavky řádně zavřenévíčka nejsou deformovaná, když je víko termocykleru zavřené.
  • Pokud problémy přetrvávají, použijte minerální olej (např. Vapor-Lock (Qiagen) nebo změňte typ či dodavatele zkumavek.

6. Klesání píků v MLPA profilu i u velikostního standardu

Klesání píků v MLPA profilu a i u velikostního standardu Intenzita signálů MLPA fragmentů a i velikostního standardu se snižuje se zvyšující se délkou.

Příčina (i)

Nastavení injekčního napětí je příliš vysoké. Pokud je injekční napětí příliš vysoké, dochází k přednostnímu injikováni krátkých fragmentů. V důsledku toho jsou píky kratších fragmentů vyšší než píky delších fragmentů.

Řešení (i)

Upravte injekční napětí.

Příčina (ii)

Polymer a/nebo kapiláry jsou příliš staré, nebo byl použit formamid nízké kvality.

Řešení (ii)

Vyměňte polymer, kapiláry nebo použijte HiDi formamid.

7. Vysoká intenzita signálů

Vysoká intenzita signálůIntenzita signálů MLPA píků je blízko nebo dokonce pod detekčním limitem kapilární elektroforézy.

Příčina

Bylo injikováno příliš mnoho PCR produktů.

Řešení

Pro snížení intenzity signálů upravte následující parametry:

  1. injekční napětí
  2. injekční čas
  3. koncentrace PCR produktů v injekční směsi

8. Vysoké Q-fragmenty

Vysoké Q-fragmentyVšechny 4 Q- fragmenty (60-70-76-82nt) jsou vyšší než 1/3 kontrolního fragmentu 92 nt.

Příčina

Pro MLPA reakci bylo použito nedostatečné množství DNA.

Řešení

Ověřte, že bylo použito minimálně 20 ng DNA pro MLPA reakci. Optimální množství DNA je 50-100 ng na MLPA reakci.

9. Jsou vidět pouze Q-fragmenty

Jsou vidět pouze Q-fragmenty V elektroforegramu jsou vidět pouze 4 Q- fragmenty 60-70-76-82 nt. Nejsou vidět žádné D-fragmenty a MLPA sondy.

Příčina

Pokud jsou vidět pouze Q-fragmenty, do MLPA reakce nebyla přidána DNA.

Řešení

Ověřte, že bylo použito minimálně 20 ng DNA pro MLPA reakci. Optimální množství DNA je 50-100 ng na MLPA reakci.

10. Nízké D-fragmenty

Nízké D-fragmentyD-fragmenty 88 nt a 96 nt jsou nižší než 40 % kontrolního fragmentu 92 nt. Sondy pro CG -bohaté sekvence mohou mít snížený signál.

Příčina

V DNA vzorku je vysoké množství kontaminujících látek, které brání jeho úplné denaturaci.

Řešení

  1. Použijte méně DNA na MLPA reakci. Naředíte tak kontaminující látky. Optimální množství DNA je 50-100 ng na MLPA reakci.
  2. Proveďte další purifikační krok, aby se odstranily kontaminující látky. Různé metody pro odstranění kontaminantů z DNA vzorků byly testovány.

11. Vysoký pík primerů

Vysoký pík primerůV elektroforegramu je vidět vysoký nespecifický pík cca 18-20 nt. Intenzita signálu píků MLPA sond a kontrolních fragmentů je nízká.

Příčina

Vysoký pík primerů indikuje neúspěšnou PCR. Polymeráza může být inhibovaná kontaminanty v DNA vzorku.

Řešení

  1. Použijte méně DNA na MLPA reakci. Tím se naředí kontaminující látky. Optimální množství DNA je 50-100 ng na MLPA reakci.
  2. Proveďte další purifikační krok, aby se odstranily kontaminující látky. Různé metody pro odstranění kontaminantů z DNA vzorků byly testovány.

12. Vysoký pík dimerů primerů

Vysoký pík dimerů primerůV elektroforegramu je vidět vysoký nespecifický pík cca 52 nt. Intenzita signálu píků MLPA sond a kontrolních fragmentů je nízká.

Příčina

K tvorbě dimerů primerů dochází nespecifickou interakcí mezi jedním z primerů a jednou z MLPA sond. To spotřebuje primer, který nemůže být inkorporovaný do MLPA profilu píků. Výsledkem je variabilita.

Řešení

Nespecifické interakce mezi primery a MLPA sondami mohou být způsobeny tím, že se provádí hot start pro zahájení PCR reakce. Nikdy neprovádějte hot start, ale místo toho přidejte polymerázu do ligačních produktů při pokojové teplotě a pokračujte v programu v termocykleru.

13. Nespecifické píky mezi MLPA sondami

Nespecifické píky mezi MLPA sondamiNespecifické píky jsou vidět mezi MLPA sondami a kontrolními fragmenty.
Poznámka: nespecifický pík cca 21 nt není vždy vidět.

Příčiny

Nespecifická tvorba píků může nastat, když se ligační master mix přidá k reakční směsi při pokojové teplotě.

Řešení

  • Pokud byl ligační master mix uložen na ledu, před přidáním do reakční směsi MLPA ho krátce zahřejte v ruce.
  • Nikdy nevyndávejte zkumavky z termocykleru, ale přidejte master mix přímo do zkumavek v termobloku.

Zkumavky nevyndávejte z termocykleru, ale master mix přidejte do zkumavek v termobloku


Pomůžeme vám s problémy s profily píků MLPA, napište nám

Položky označené hvězdičkou (*) jsou povinné.

Vaše osobní údaje nejsou nikde zveřejňovány a splňují požadavky GDPR.

Kontaktujte nás

BIOGEN PRAHA s.r.o.
Ke sv. Izidoru 2293/4A
140 00 PRAHA 4

Tel.: +420 241 401 693
Fax: +420 241 401 694
E-mail: biogen@biogen.cz

Novinky na e-mail

Vaše osobní údaje nejsou nikde zveřejňovány a splňují požadavky GDPR.