Úvod Magazín SALSA MLPA probemix P062-D2 LDLR

SALSA MLPA probemix P062-D2 LDLR

Verze D2

V porovnání s kitem D1 byla nahrazena délka jedné cílové sondy (žádná změna v detekované sekvenci). Více informací se dočtete na následujících řádcích.

Katalogová čísla:

  • P062-025R: SALSA® MLPA® probemix P062 LDLR, 25 reakcí.
  • P062-050R: SALSA® MLPA® probemix P062 LDLR, 50 reakcí.
  • P062-100R: SALSA® MLPA® probemix P062 LDLR, 100 reakcí.

K použití v kombinaci s kitem SALSA MLPA EK1 (100 reakcí) nebo EK5 (500 reakcí). MLPA reagenční kity jsou k dispozici s různými fluorescenčními barvivy: EK1-FAM, EK5-FAM (Applied Biosystems sekvenátory) a EK1-Cy5.0, EK5-Cy5.0 (Beckman sekvenátory).

Účel použití:

Tento kit probemix P062 LDLR je testem pro in vitro diagnostiku (IVD)1 nebo pouze pro výzkumné účely (RUO) a detekuje změny v počtu kopií genu pro lidský nízkodenzitní lipoproteinový receptor (LDLR, lokalizovaný na chromozomu 19q13.2) jako potenciální příčina a klinická diagnóza pro familiární hypercholesterolémii. Tento test může být použit s lidskou DNA odvozenou z periferní krve.

Většina defektů v genu LDLR jsou bodové mutace, z nichž většina nebude detekována MLPA. Proto doporučujeme používat tento kit v kombinaci se sekvenační analýzou genu LDLR. Změny v počtu kopií detekované pouze jedinou sondou vždy vyžadují ověření jinou metodou. Tento kit není určen pro použití jako samostatný test pro klinické rozhodování. Výsledky tohoto testu by měly být interpretovány klinickým/molekulárním genetikem nebo ekvivalentním odborníkem.

Certifikát analýzy: 

Informace o podmínkách skladování, testech kvality a vzoru elektroforeogramu z aktuální šarže je k dispozici na adrese mlpa.com

Bezpečnostní opatření a varování: 

Kit je určen pouze pro profesionální použití. Vždy si před použitím pročtěte nejnovější popis produktu a MLPA obecný protokol. Je odpovědností uživatele, aby se seznámil s nejnovějšími vědeckými poznatky, než bude vyvozovat závěry z výsledků získaných s tímto produktem.

1Berte prosím na vědomí, že tento kit je pro in vitro diagnostické použití (IVD) v zemích uvedených v Osvědčení o analýze, které je k dispozici na mlpa.com. Ve všech ostatních zemích je výrobek určen pouze pro výzkumné účely (RUO).

Klinické pozadí

Nízkodenzitní lipoproteinový receptor (LDLR) je receptor buněčného povrchu, který hraje důležitou roli v homeostázi cholesterolu. Receptor váže a internalizuje částice LDL-cholesterolu v krvi pomocí endocytózy. Tento proces probíhá ve všech jaderných buněk, ale hlavně v játrech, které jsou odpovědné za ~ 70 % z celkového odstranění LDL-cholesterolu z oběhu.

Familiární hypercholesterolémie (FH) je autosomálně dominantní onemocnění charakterizované silně zvýšenými hladinami LDL cholesterolu, které způsobují usazování aterosklerotických plaků v tepnách, což může vést k ischemické chorobě srdeční (CHD) v raném věku. Heterozygotní FH má celosvětovou prevalenci 1:200 - 500. Přibližně 60 - 80 % z FH je způsobeno patogenními variantami v LDLR, APOB nebo PCSK9 genech. Většina defektů se nachází v genu LDLR, méně než 5 % pacientů FH mají patogenní mutaci v APOB nebo PCSK9 genu. Ve zbývajících 20 - 40 % případech je základní genetický defekt neznámý. Homozygotní FH je mnohem vzácnější (1:160 000 - 1 000 000) a je výsledkem bialelických mutací v jednom ze známých genů nebo jednou mutací v každém ze dvou různých genů.

Závažnost symptomů je závislá na typu mutace; úplná ztráta funkčních variant obvykle vede k závažnému onemocnění. Heterozygotní FH pacienti mají přibližně 20násobně zvýšené riziko ischemické choroby srdeční, zatímco většina homozygotních FH pacientů má závažnou CHD ve věku okolo 20 let a podstupují koronární bypass v dospívání.

Struktura genu a transkripční varianty:

LDLR gen (18 exonů) pokrývá ~ 42,8 kb genomové DNA a je lokalizován na chromozómu 19p13.2, ~ 11 Mb od p-telomery. LRG sekvence pro tento gen je k dispozici na http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/lrgex/LRG_274.xml. Popsáno bylo několik variant protein-kódujících transkriptů (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3949). Transkripční varianta 1 (NM_000527.4, 5292 nt, kódující sekvence 188-2770) je nejdelší transkript a kóduje nejdelší izoformu. Tato sekvence je referenční standard v rámci projektu NCBI RefSeq Gene.

Číslování exonů:

Číslování exonů použité v tomto popisu P062-D2 LDLR kitu a v analýze listu P062-D2 LDLR Coffalyser.Net je číslování exonů z referenční sekvence Genbank NG_009060.1, která je identická se sekvencí LRG.

Obsah P062-D2 kitu:

Tento SALSA MLPA kit P062 LDLR obsahuje:

  • 33 MLPA sond s amplifikačními produkty mezi 136 a 490 nt:
  • 20 sond je umístěných v genu LDLR, 1 přilehlá sonda před genem LDLR, 12 referenčních sond detekující autosomální chromozomy (viz Tabulka 1 a 2).
Identita genů detekovaných referenčními sondami je k dispozici on-line (mlpa.com).

Tento kit obsahuje:

  • 9 kontrolních fragmentů, které generují amplifikační produkty mezi 64 a 105 nt:
  • 4 DNA kvantitativní fragmenty (Q-fragmenty)
  • 3 DNA denaturační fragmenty (D-fragmenty)
  • 1 chromozóm X a 1 chromozóm Y-specifický fragment (Tabulka 1).
Q-fragmenty jsou viditelné pouze, pokud je použito méně než 100 ng DNA vzorku. Nízký signál 88 nebo 96 nt fragmentu naznačuje neúplnou DNA denaturaci. Více informací o tom, jak interpretovat výsledky z těchto kontrolních fragmentů, můžete nalézt v MLPA obecném protokolu.

MLPA metoda

Principy MLPA metody (Schouten et al 2002) jsou popsány v MLPA obecném protokolu.

Validace MLPA metody: 

Interní validace MLPA metody na 16 vzorcích DNA ze zdravých jedinců je nezbytná, a to zejména při prvním použití MLPA, nebo při změně zpracování vzorků, metodě extrakce DNA nebo používaného přístroje. Tato validace by měla vykazovat standardní odchylku <0,10 pro všechny sondy v experimentu.

Požadavky na vzorky: Izolovaná DNA z periferní krve bez nečistot, které ovlivňují MLPA reakci. Více informací naleznete v části o zpracování DNA vzorku v MLPA obecném protokolu.

Referenční vzorky:

Referenční vzorky DNA by měly být odvozeny ze stejného typu tkáně, zpracovány za použití stejného postupu a připraveny za použití stejného způsobu, jako je například extrakce DNA ze vzorku pacienta. Referenční vzorky by měly být odvozeny od nepříbuzných jedinců, kteří jsou z rodin bez historie familiární hypercholesterolémie. Další informace týkající se výběru a použití referenčních vzorků lze nalézt v MLPA obecném protokolu.

Pozitivní kontrolní vzorky DNA:

MRC-Holland nemůže poskytnout pozitivní vzorky DNA. Zahrnutí pozitivních vzorků se doporučuje v každém experimentu.

Charakteristika výkonu testu:

Většina FH mutací jsou způsobeny bodovými mutacemi v genu LDLR a měly by být identifikovány sekvenační analýzou. Odhaduje se, že ~ 10 % patogenních mutací v genu LDLR je kvůli velkým přestavbám. Přesné procento se liší mezi populacemi; od méně než 2 % (např. v české populaci) až po více než 20 % v některých kanadských oblastech (Nordestgaard et al. 2013, Goldmann a kol., 2010). Použití MLPA pro detekci přestaveb v genu LDLR je cenným doplňkem k diagnostice FH. Sekvenování a MLPA analýza genu LDLR vede ke konečné diagnóze u 60 - 80 % pacientů s FH. V ostatních případech, genetická příčina není známá.

Výkon může být ohrožen:

  • SNP nebo dalšími polymorfismy (např. indels) v cílové sekvenci DNA
  • nečistotami ve vzorku DNA
  • neúplnou DNA denaturací
  • použitím nedostatečného nebo příliš velkého množství vzorku DNA
  • použitím nedostatečných nebo nevhodných referenčních vzorků
  • problémy s kapilární elektroforézou nebo špatným postupem normalizace dat a dalšími technickými chybami.

MLPA obecný protokol obsahuje technické pokyny a informace o hodnocení/normalizaci dat.

Analýza dat:

Coffalyser.Net software musí být pro analýzu dat použit v kombinaci s listem pro specifickou šarži - MLPA Coffalyser list. Nejnovější verze by měla být použita a je volně ke stažení na mlpa.com. Použití jiného, ne-proprietárního softwaru může vést k neprůkazným nebo falešným výsledkům. Metoda analýzy pro P062-D2 používá blokovou normalizaci. Normalizace výsledků by měla být provedena v jednom experimentu. Pro více informací o MLPA kontrole kvality a analýze dat, viz Coffalyser.Net Manual.

Interpretace výsledků:

Očekávané výsledky pro LDLR specifické MLPA sondy jsou počty kopií:

  • alel 2 (normální)
  • 1 (heterozygotní delece)
  • 3 (heterozygotní duplikace).

Ve vzácných případech je počet kopií:

  • 0 (homozygotní delece)
  • 4 (heterozygotní triplikace/homozygotní duplikace).

Standardní odchylka všech sond v referenčních vzorcích by měla být <0,10 a kvocient dávky (DQ) referenčních sond ve vzorcích pacientů by měl být mezi 0,80 a 1,20. Pokud jsou tato kritéria splněna, následující mezní hodnoty pro DQ sond mohou být použity k interpretaci výsledků MLPA

Uspořádání sond podle umístění na chromozomu usnadňuje interpretaci výsledků a může odhalit jemnější změny, jako byly zaznamenány u mozaikových případů. Analýza rodičovských vzorků může být nezbytná pro správnou interpretaci komplexních výsledků.

Falešně pozitivní výsledky:

Vezměte prosím na vědomí, že abnormality zjištěné jedinou sondou (nebo více po sobě jdoucích sond) mají stále značnou šanci být falešně pozitivní výsledek. Neúplná DNA denaturace (například z důvodu kontaminace solí) může vést ke snížení signálu sondy, zejména u sond umístěných v CpG ostrově nebo v blízkosti genu LDLR. Použití dalšího kroku čištění nebo alternativní metody extrakce DNA může takové případy vyřešit.

Falešné pozitivní výsledky - duplikace:

Kontaminace DNA vzorků cDNA nebo PCR amplikony z jednotlivých exonů mohou vést k falešně pozitivním duplikacím (Varga et al., 2012). Analýza nezávisle odebraného vzorku sekundární DNA může vyloučit tento typ artefaktů.

Varianty normálního počtu kopií u zdravých jedinců jsou popsány v databázi genomových variant: http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home. Uživatelé by měli vždy konzultovat nejnovější aktualizaci databáze a vědecké poznatky při interpretaci jejich výsledků.


Ne všechny odchylky zjištěné MLPA jsou patogenní. V některých genech, intragenové delece jsou známy a vedou k velmi mírné nebo žádné chorobě (Schwartz et al., 2007). Pro mnoho genů existuje více než jedna transkripční varianta. Změny v počtu kopií exonů, které nejsou přítomny ve všech transkripčních variantách, nemusí mít klinický význam. Duplikace, které zahrnují první nebo poslední exon genu (například exony 1-3), mohou mít v některých případech za následek inaktivaci této kopie genu.

Změny v počtu kopií detekované referenčními sondami nebudou mít pravděpodobně žádný vztah k testovanému onemocnění.

Limitace metody:

  • Ve většině populací jsou hlavní příčinou genetických defektů v LDLR genu malé (bodové) mutace, z nichž většina nebude detekována pomocí MLPA kitu P062 LDLR.
  • MLPA nemůže zjistit žádné změny, které leží mimo cílovou sekvenci sond a nezjistí počet kopií neutrální inverze nebo translokace. I když MLPA nedetekuje žádné aberace, zůstává možnost, že existují biologické změny v tomto genu nebo chromozomální oblasti, ale zůstávají nezjištěné.
  • Změny sekvence (např. SNP, bodové mutace, malé indels) v cílové sekvenci sondy mohou způsobit falešně pozitivní výsledky. Mutace / SNP (i když> 20 nt od ligačního místa sondy) může snižovat signál sondy tím, že brání ligaci oligonukleotidové sondy nebo destabilizuje vazbu sondy na DNA.

Potvrzení výsledků: 

Změny v počtu kopií detekované pouze jedinou sondou vždy vyžadují ověření jinou metodou. Zřejmá delece detekovaná jedinou sondou může být způsobena např. mutací/polymorfismem, který zabraňuje ligaci nebo destabilizuje vazbu sondy na DNA. Sekvenační analýza může stanovit, zda jsou mutace nebo polymorfismy přítomny v cílové sekvenci sondy. Nalezení heterozygotní mutace nebo polymorfismu poukazuje na to, že jsou ve vzorku DNA přítomny dvě odlišné alely a lze získat falešně pozitivní výsledek MPLA.

Změny v počtu kopií detekované jednou nebo více než jednou po sobě jdoucích sond by měly být potvrzeny jinou nezávislou metodou, jako je long-range PCR, qPCR, array CGH nebo Southern blotting, kdykoli je to možné. Delece / duplikace delší než 50 kb mohou být často potvrzeny FISH.

Databáze LDLR mutací:

Uživatelům doporučujeme ukládat pozitivní výsledky do UCL LDLR databáze variant. Doporučení pro názvosloví, jak popisovat delece / duplikace jednoho nebo více exonů lze nalézt na www.hgvs.org/mutnomen/. A prosím, oznamte nám změny v počtu kopií detekované referenčními sondami, falešně pozitivní výsledky kvůli SNP a neobvyklé výsledky, případně napište do MRC-Holland na adresu info@mlpa.com (například duplikace LDLR exonů 6 a 8, ale ne exonu 7).

a) Číslování exonů použité v tomto popisu P062-D2 LDLR kitu a v analýze listu P062-D2 LDLR Coffalyser.Net je číslování exonů z referenční sekvence Genbank NG_009060.1, která je identická se sekvencí LRG.

  • * Změněno ve verzi D2 (od šarže D2-1115 dále). Malá změna délky, žádná změna v detekované sekvenci.
  • Ж Tato sonda se skládá ze tří částí a má dvě ligační místa. Tento typ sondy je citlivější na depurinaci, například, když je pufrační kapacita nedostatečná.
  • ¬ Doprovodná sonda. Zahrnuta pro určení rozsahu delece/duplikace. Změny v počtu kopií pouze doprovodných nebo referenčních sond pravděpodobně nesouvisí s testovanou nemocí.
  • ± Ligační místo se nachází mimo sekvenci exonů.

a) Číslování exonů použité v tomto popisu P062-D2 LDLR kitu a v analýze listu P062-D2 LDLR Coffalyser.Net je číslování exonů z referenční sekvence Genbank NG_009060.1, která je identická se sekvencí LRG.
b) Ligační místa P062 LDLR MLPA sond jsou označeny podle Refseq sekvence NM_000527.4 obsahující 18 exonů.
c) Uvedena je pouze část sekvence sond. Kompletní sekvence sond jsou k dispozici na mlpa.com. Prosím, dejte nám vědět, pokud najdete nějaké chyby nebo napište na adresu info@mlpa.com.

  • Ж Tato sonda se skládá ze tří částí a má dvě ligační místa. Tento typ sondy je citlivější na depurinaci, například když je nedostatečná pufrační kapacita.
  • ¬ Doprovodná sonda. Zahrnuta pro určení rozsahu delece/duplikace. Změny v počtu kopií pouze doprovodných nebo referenčních sond pravděpodobně nesouvisí s testovanou nemocí.
  • ± Ligační místo se nachází mimo sekvenci exonů.

Reference

  • Goldmann R et al. (2010). Genomic characterization of large rearrangements of the LDLR gene in Czech patients with familial hypercholesterolemia. BMC Med Genet . 11:115.
  • Kassner U et al. (2014). Clinical utility gene card for: Hyperlipoproteinemia, TYPE II. Eur J Hum Genet. 22 (7): e1-e4.
  • Nordestgaard BG et al. (2013). Familial hypercholesterolaemia is underdiagnosed and undertreated in the general population: guidance for clinicians to prevent coronary heart disease. Consensus Statement of the European Atherosclerosis Society. Eur Heart J. 34, 3478-3490.
  • Raal FJ et al. (2011). Reduction in Mortality in Subjects With Homozygous Familial Hypercholesterolemia Associated With Advances in Lipid-Lowering Therapy. Circulation. 124 (20): 2202-7.
  • Schouten JP et al. (2002). Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation- dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. 30:e57.
  • Schwartz M et al. (2007). Deletion of exon 16 of the dystrophin gene is not associated with disease. Hum Mutat. 28:205.
  • Varga RE et al. (2012). MLPA-based evidence for sequence gain: pitfalls in confirmation and necessity for exclusion of false positives. Anal Biochem. 421:799-801.

Vybrané publikace používající kit SALSA MLPA P062 LDLR

  •  Ahmad Z et al. (2012). Low prevalence of mutations in known loci for autosomal dominant hypercholesterolemia in a multiethnic patient cohort. Circ Cardiovasc Genet. 5(6):666-75.
  •  Al-Khateeb A et al. (2011). Analysis of sequence variations in low-density lipoprotein receptor gene among Malaysian patients with familial hypercholesterolemia. BMC Med Genet. 2011;12:40.
  • Chiou KR and Charng MJ. (2010). Detection of mutations and large rearrangements of the low-density lipoprotein receptor gene in Taiwanese patients with familial hypercholesterolemia. American J Cardiol . 105(12):1752-8.
  • Faiz F et al. (2013). Detection of variations and identifying genomic breakpoints for large deletions in the LDLR by Ion Torrent semiconductor sequencing. Atherosclerosis. 230(2):249-55.
  • Feddersen S et al. (2013). Duplication of exon 7-12 in the low-density lipoprotein receptor gene in three Danish patients with familial hypercholesterolemia. J Clin Lipidol . 7(2):174-7.
  • Fouchier SW et al. (2005). Update of the molecular basis of familial hypercholesterolemia in The Netherlands. Hum Mutat. 26(6):550-6.
  • Futema M et al. (2012). Use of targeted exome sequencing as a diagnostic tool for Familial Hypercholesterolaemia. J Med Genet. 49(10):644-9.
  • Ho CK et al. (2012). Genetic mutations in patients with possible familial hypercholesterolaemia in South East Scotland. Scot Med J. 57(3):148-51.
  • Holla O et al. (2005). Identification of deletions and duplications in the low density lipoprotein receptor gene by MLPA. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 356(1-2):164-71.
  • Hollants S et al. (2012). Microfluidic amplification as a tool for massive parallel sequencing of the familial hypercholesterolemia genes. Clinical chemistry. 58(4):717-24.
  • Hooper AJ et al. (2012). Genetic analysis of familial hypercholesterolaemia in Western Australia. Atherosclerosis. 224(2):430-4.
  • Jelassi A et al. (2012). Genomic characterization of two deletions in the LDLR gene in Tunisian patients with familial hypercholesterolemia. Clin Chim Acta. 414:146-51.
  • Marduel M et al. (2010). Molecular spectrum of autosomal dominant hypercholesterolemia in France. Hum Mutat. 31(11):E1811-24.
  • Medeiros AM et al. (2010). Update of the Portuguese Familial Hypercholesterolaemia Study. Atherosclerosis. 212(2):553-8.
  • Miyake Y et al. (2009). Update of Japanese common LDLR gene mutations and their phenotypes: Mild type mutation L547V might predominate in the Japanese population. Atherosclerosis. 203(1):153-60.
  • Norsworthy PJ et al. (2014). Targeted genetic testing for familial hypercholesterolaemia using next generation sequencing: a population-based study. BMC Med Genet. 15:70.
  • Rabacchi C et al. (2009). An apparent inconsistency in parent to offspring transmission of point mutations of LDLR gene in familial hypercholesterolemia. Clin Chim Acta. 406(1-2):75-80.
  • Taylor A et al. (2009). Multiplex ligation-dependent probe amplification analysis to screen for deletions and duplications of the LDLR gene in patients with familial hypercholesterolaemia. Clin Genet. 76(1):69-75.
  • Taylor A et al. (2010). Mutation detection rate and spectrum in familial hypercholesterolaemia patients in the UK pilot cascade project. Clin Genet. 77(6):572-80.
  • Tichy L et al. (2012). The molecular basis of familial hypercholesterolemia in the Czech Republic: spectrum of LDLR mutations and genotype-phenotype correlations. Atherosclerosis. 223(2):401-8.
  • Tosi I et al. (2007). Genetic defects causing familial hypercholesterolaemia: identification of deletions and duplications in the LDL-receptor gene and summary of all mutations found in patients attending the Hammersmith Hospital Lipid Clinic. Atherosclerosis. 194(1):102-11.
  • Wang J et al. (2005). Multiplex ligation-dependent probe amplification of LDLR enhances molecular diagnosis of familial hypercholesterolemia. J Lipid Res. 46(2):366-72.  

Máte zájem o tento kit, nebo se chcete na něco zeptat? Napište nám

Položky označené hvězdičkou (*) jsou povinné.

Vaše osobní údaje nejsou nikde zveřejňovány a splňují požadavky GDPR.

Kontaktujte nás

BIOGEN PRAHA s.r.o.
Ke sv. Izidoru 2293/4A
140 00 PRAHA 4

Tel.: +420 241 401 693
Fax: +420 241 401 694
E-mail: biogen@biogen.cz

Novinky na e-mail

Vaše osobní údaje nejsou nikde zveřejňovány a splňují požadavky GDPR.